雞球蟲3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保護效果.pdf

1、球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的一類嚴重的寄生蟲病,在抗球蟲免疫反應中,細胞免疫反應所起的作用要大于體液免疫的作用,為了研究核酸疫苗和重組蛋白疫苗對雞球蟲病的防治效果,進行了以下試驗:1.球蟲子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)的克隆:分別以E.tenella GS和E.acervulina QH株孢子化卵囊總RNA為模板,按照GenBank發(fā)表的序列合成引物,進行RT-PCR,擴增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接后,轉化入JM109感受態(tài)

2、細胞,將PCR和酶切鑒定正確的陽性菌落進行測序.結果表明,擴增的兩個蟲株的3-1E基因的ORF大小均為513bp,共編碼171個氨基酸,Et GS 3-1E與文獻報道的Ea 3-1E同源性為99.6﹪,Ea QH 3-1E與文獻報道的Ea 3-1E同源性為99.2﹪,Et GS 3-1E與Ea QH 3-1E同源性為99.6﹪;Et GS CDPK的ORF為1470個堿基,共編碼490個氨基酸,與文獻報道的Et CDPK同源性為99.6

3、﹪.2.基因的表達與純化:按照pGEX-6P1表達載體的多克隆位點,重新設計添加相應酶切位點的引物,進行Et.GS株3-1E和CKPK基因的亞克隆,將亞克隆的基因與表達載體進行酶切后連接,將鑒定正確的陽性菌落轉化其宿主菌BL21進行誘導表達,并將表達產(chǎn)物通過GST純化柱進行了純化.通過SDS-PAGE表明,在加入IPTG誘導劑5h左右即可達到較高水平的表達,其中pGEX-3-1E表達產(chǎn)物占菌體總蛋白的43.3﹪,pGEX-CDPK表達產(chǎn)

4、物占菌體總蛋白的35.4﹪.表達的融合蛋白均為可溶性蛋白,將超聲裂解后的上清直接過柱純化,得到了高純度的重組蛋白.3.真核表達質粒的構建及體外表達檢測:將所克隆的3-1E、CDPK基因以及IFN-γ單獨或串連于真核表達質粒pcDNA3.1/Zeo(+),成功構建了單價、雙價和三價的真核重組質粒;pcI、pcC、pcE、pcCE、pcEI、pcCEI等7種.通過脂質體轉染試劑盒將pcE和pcC真核重組質粒轉染入BHK細胞,收集對數(shù)生長期的

5、細胞,提取細胞的總RNA,反轉錄之后使用特異性引物進行PCR擴增,檢測質粒在細胞中的轉錄情況,瓊脂糖電泳檢測到各自的特異性條帶,說明pcE和pcC真核重組質?？稍谡婧思毎姓T導表達蛋白.4.真核表達質粒和重組蛋白的免疫原性研究及體內表達檢測:采用MTT法對構建的真核表達質粒和重組蛋白進行了淋巴細胞轉化試驗,研究表明,在一免后7天,各免疫組淋轉水平均有不同程度的提高,在二免后7天和感染后7天,各免疫組淋轉水平有顯著性提高,說明隨著免疫時間

6、的延長及加強免疫后,各免疫組具有較強的誘導雞的細胞免疫反應的能力.通過對pcE和pcC免疫組肌肉組織基因組DNA的提取、總RNA的提取,反轉錄、PCR鑒定結果表明,核酸疫苗至少可在體內存在并持續(xù)表達1個月.5.真核表達質粒和重組蛋白對球蟲感染雞的保護研究:在每次核酸疫苗免疫雞只前對注射部位進行25﹪蔗糖的預處理,間隔一周兩次免疫,二兔后7天攻擊3×10<'4>個Et GS卵囊,7天后殺雞觀察免疫組的保護效果.結果表明,免疫組與感染對照組