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文檔簡介
1、纖維素酶是一組能降解纖維素的酶的總稱。該酶廣泛存在于各種微生物中,如細(xì)菌、真菌、放線菌等;此外,在動物中也發(fā)現(xiàn)該酶的存在。但到目前為止,對該酶的研究仍多以中溫好氣性木霉(Trichoderma)為主。因此,為了提高纖維素酶的產(chǎn)率和加速對纖維素酶降解纖維素機制的研究,一些極端條件下高活力的纖維素分解菌已經(jīng)引起科研工作者的重視,尤其是對嗜熱真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜熱真菌具有產(chǎn)酶快且產(chǎn)量大、分解纖維素效率高等特性
2、,是一類非常具有開發(fā)潛力的纖維素分解菌。 疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種廣泛分布的,生長上限溫度較高的一種嗜熱真菌,本實驗室從該菌中已分離了多種嗜熱酶,但還未分離到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纖維素為唯一碳源的合成培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生了外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶,通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sep
3、harose Fast Flow陰離子層析、Phenyl-Sepharose疏水層析等步驟獲得了凝膠電泳均一的外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。經(jīng)12.5%SDS-PAGE和凝膠過濾層析方法測得兩種酶的分子量大小分別約為46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。 外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶的反應(yīng)最適溫度為60℃,最適pH值為5.0,在60℃保溫30min活性喪失5%,在70℃時的半衰期為35min,在
4、80V保溫10min仍具有60%的活性,80℃下酶的半衰期為25min,在90℃下保溫10min仍有12%的活性。Na<'+>K<'+>、Mn<'3+>對外切β-葡聚糖纖維二糖水解酶活性影響不大;Ca<'2+>、Ba<'2+>、Mg<'2+>離子對酶有明顯的激活作用,Ag<'+>、Zn<'2+>、NH<,4><'+>等對酶有抑制作用。該酶的Km值為9.56 mg/mL,Vmax為22.12 mg/mL.min。 β-葡萄糖苷酶的
5、反應(yīng)最適溫度為60℃,最適pH值為5.0,在60℃保溫1小時活性基本不喪失,在70℃的半衰期是15min,在80℃保溫10min仍具有30%的活性。在90℃下保溫10min仍有10%的活性。Ca<'2+>、Ba<'2+>、 Mg<'2+>對β-葡萄糖苷酶有激活作用,Na<'+>、K<'+>、Mn<'2+>對酶活性影響不大,而Ag<'+>、NH<,4><'+>、Zn<'2+>對酶有顯著的抑制作用。該酶的Km值為1.98mg/mL,Vmax
6、為11.94mg/mL.min。 根據(jù)12種真菌熱穩(wěn)定外切葡聚糖酶的同源保守序列設(shè)計兼并性引物,通過RT-PCR及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosus外切葡聚糖酶的編碼基因cbh,全長cDNA為1710bp,包含一個由457個氨基酸組成的開放閱讀框。通過Signal.P服務(wù)器的SignalP-NN和SignalP-HNN兩種軟件我們對推測的外切β-葡聚糖纖維二
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