煙草類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD1的克隆、表達(dá)分析及功能研究.pdf

1、類胡蘿卜素及其衍生物是煙葉重要致香物質(zhì)及抗逆物質(zhì)的前體物，不僅決定了調(diào)制后煙葉的顏色，其降解產(chǎn)物的種類及含量是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，近年來一直是煙草致香物研究的熱點(diǎn)。對(duì)煙草類胡蘿卜素代謝途徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行深入研究，明確重要基因的功能，可為改良煙草類胡蘿卜素代謝，提高煙葉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。
　　類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase，CCDs)是植物類胡蘿卜素降解代謝途徑中的關(guān)鍵基因

2、，CCDs家族有9個(gè)成員，其中，CCD1編碼的基因的作用最為復(fù)雜。本研究采用RACE方法克隆了煙草品種K326中類胡蘿卜素降解途徑的關(guān)鍵基因CCD1，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。采用RT-PCR方法分析了CCD1基因在不同組織、生態(tài)區(qū)及品種中的基因表達(dá)差異情況。同時(shí)采用in-fusion和gateway方法分別構(gòu)建了過表達(dá)和抑制表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草植株，同時(shí)構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，目的是揭示類

3、胡蘿卜素降解內(nèi)在的分子機(jī)制，從而為從分子水平上進(jìn)行代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.克隆得到烤煙品種K326類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD13個(gè)拷貝CCD1-1、CCD1-2和CCD1-3，并提交NCBI Genbank，登錄號(hào)KC747729，KC747730和KM605431。序列分析表明:三個(gè)拷貝ORF分別為1635、1647和1641bp。分別編碼544、548和546個(gè)氨基酸。序列GC含量為43.2

4、4、42.87和43.14％。預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為均為61 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.51、6.55和6.25。系統(tǒng)發(fā)育分析表明:K326 CCD1核苷酸序列與其他茄科類物種的CCD1的核苷酸有很高的相似度;氨基酸序列分析表明:它們均包含CCD家族保守的結(jié)構(gòu)域;蛋白質(zhì)疏水性分析、跨膜區(qū)預(yù)測和螺旋卷曲分析表明它們均包含跨膜區(qū)域，沒有明顯的卷曲螺旋。對(duì)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明β折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成了CCD1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分。

5、三維結(jié)構(gòu)模擬表明:這三個(gè)拷貝三維結(jié)構(gòu)極其相似，僅在無規(guī)則卷曲部分存在差異。
　　2.采用RT-PCR分析了K326中CCD1-1與CCD1-2基因在煙株根、莖、葉和花中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CCD1-1和CCD1-2均在花中的表達(dá)最強(qiáng)，在葉和莖中的表達(dá)其次，根中的表達(dá)最弱。對(duì)河南煙區(qū)種植的K326品種基因表達(dá)分析結(jié)果顯示成熟期河南煙葉類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD1基因表達(dá)更為活躍。打頂后對(duì)濃香型亞生態(tài)區(qū)廣東南雄、安徽宣城和河南平頂山種植

6、的K326比較發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素降解關(guān)鍵基因CCD1在廣東南雄表達(dá)量相對(duì)較高，為評(píng)價(jià)不同產(chǎn)區(qū)煙葉的質(zhì)量風(fēng)格提供依據(jù)。物質(zhì)代謝分析顯示廣東南雄的煙葉色素含量最高，安徽次之，河南平頂山的煙葉最低。此外，河南煙區(qū)與類胡蘿卜素降解有關(guān)的基因CCD1和CCD3基因在豫煙10號(hào)中的表達(dá)明顯強(qiáng)于K326。安徽地區(qū)K326的基因表達(dá)總體要強(qiáng)于安煙240。廣東地區(qū)K326的基因表達(dá)都要高于NX232。
　　3.構(gòu)建了K326 CCD1基因的過表達(dá)和R

7、NAi表達(dá)載體，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草植株。獲得CCD1-1、CCD1-2和CCD1-3過表達(dá)和CCD1-3抑制表達(dá)陽性植株。熒光定量分析表明，CCD1過表達(dá)植株表達(dá)量有所提高;CCD1-3 RNAi轉(zhuǎn)基因株系中的CCD1基因表達(dá)明顯降低。此外，成功構(gòu)建了K326 CCD1基因三個(gè)拷貝的原核表達(dá)載體，用分別捕獲這些重組質(zhì)粒大腸桿菌感受態(tài)BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果表明:IPTG誘導(dǎo)后能夠表達(dá)可溶