番茄紅素環(huán)化酶基因在煙草類胡蘿卜素合成中的作用研究.pdf

1、隨著環(huán)境的日益惡化，水資源緊缺以及土壤鹽堿化成為了世界性的問題，培育抗逆的植物品種已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的當務之急。類胡蘿卜素是植物體內(nèi)一種重要的色素，作為植物光合系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的重要成員，在植物生長發(fā)育和抵御逆境的過程中起著重要的作用。番茄紅素環(huán)化酶，包括ε番茄紅素環(huán)化酶和β番茄紅素環(huán)化酶，它們位于高等植物類胡蘿卜素合成通路的分支點上，是類胡蘿卜素合成的關鍵酶，催化番茄紅素向α或β類胡蘿卜素的轉化。
　　本文分別對煙草中ε番茄紅素環(huán)化

2、酶和β番茄紅素環(huán)化酶基因進行克隆，并對其遺傳背景和表達模式進行分析，利用病毒誘導基因沉默（VIGS）和轉基因技術對兩個基因在類胡蘿卜素合成及抗逆中的作用進行了詳細的研究，主要研究內(nèi)容如下：
　?。?）采用同源克隆的方法得到普通煙草Ntε-LCY基因，設計跨內(nèi)含子保守引物從煙草DNA組中進行PCR擴增，采用凝膠電泳和毛細管電泳技術對PCR產(chǎn)物進行分離分析，發(fā)現(xiàn)普通煙草基因組內(nèi)存在兩個Ntε-LCY基因拷貝，命名為Ntε-LCY1和N

3、tε-LCY2；遺傳進化分析結果表明Ntε-LCY1和Ntε-LCY2分別來源于林煙草和絨毛狀煙草，兩個基因編碼區(qū)核酸序列相似度高達97％，氨基酸序列高達95%?；虮磉_模式分析結果顯示 Ntε-LCY基因在各個組織器官中都有表達，但在葉中表達量最高，而且該基因受低溫弱光條件誘導表達。亞細胞定位結果顯示 Ntε-LCY1成熟蛋白定位在葉綠體中。利用 VIGS在本氏煙草中對ε-LCY基因功能進行了初步研究，利用HPLC-UV對煙草代謝物類

4、胡蘿卜素進行分離檢測，發(fā)現(xiàn)ε-LCY基因的表達抑制增加了β-分支類胡蘿卜素的含量，降低了α分支類胡蘿卜素的含量，煙草體內(nèi)類胡蘿卜素合成相關基因的表達量也顯著提高，同時改善了煙草對光抑制的抵御能力。借助轉基因技術通過RNA干擾（RNAi）和過量表達煙草中的Ntε-LCY基因，進一步的研究了Ntε-LCY在植物中的生理功能。在Ntε-LCY RNAi植株中提高了類胡蘿卜素合成相關基因的表達量和β分支類胡蘿卜素的含量。在鹽和干旱脅迫條件下，N

5、tε-LCY RNAi轉基因植株具有較高的相對含水量和較少的活性氧含量。利用UPLC-MS/MS對脅迫前后Ntε-LCY RNAi轉基因及對照煙草中ABA含量進行分析，發(fā)現(xiàn)轉基因煙株中具有較高的ABA含量，充分說明Ntε-LCY表達抑制顯著提高了植物對高鹽和干旱的適應能力。相反地Ntε-LCY過量表達則降低了煙株的抗鹽抗旱能力。
　?。?）采用同源克隆的方法從普通煙草中克隆得到Ntβ-LCY基因，并分析了其遺傳背景，煙草 Ntβ-

6、LCY基因與茄科植物的蛋白相似度高達89%以上，與模式植物擬南芥相似度高達77%，且與祖先種煙草絨毛煙草氨基酸序列相似性高達99.8%，表明β-LCY基因是一個進化較為保守的基因，同時也推斷克隆的Ntβ-LCY基因可能來源于絨毛狀煙草。表達模式分析結果表明該基因在煙株生理作用比較旺盛的嫩葉中具有較高的表達量，且易于受植物激素和逆境誘導表達。亞細胞定位顯示該蛋白定位在葉綠體中。利用煙草脆裂病毒（TRV）介導的病毒誘導基因沉默技術，初步探討

7、了煙草β-LCY基因生物學功能，煙草中β-LCY基因表達抑制，使煙草葉片嚴重黃化，植株生長發(fā)育不良，矮化明顯，類胡蘿卜素及葉綠素含量急劇減少，并導致光合作用能力下降。由于β-LCY沉默導致顯著的表型特征，所以該研究為TRV VIGS提供了良好的可選參照基因。通過轉基因技術，利用RNA干擾和過量表達的方法，進一步研究該基因的生物學功能。在Ntβ-LCY RNAi轉基因煙草中，Ntβ-LCY基因的沉默使煙草出現(xiàn)嚴重的白化現(xiàn)象，嚴重者則會在苗

8、期逐漸死亡。定量PCR及代謝分析結果顯示，Ntβ-LCY基因的表達抑制嚴重的影響了類胡蘿卜素合成相關基因的轉錄表達和類胡蘿卜素物質的正常合成，并且影響了信號分子ABA的合成，顯著降低了植物抵御逆境的能力。過量表達Ntβ-LCY基因，轉基因煙草沒有明顯的可視表型，定量PCR和代謝結果表明，該基因的過量表達提高了類胡蘿卜素合成相關基因的表達和類胡蘿卜素及葉綠素含量。在鹽和干旱逆境脅迫條件下，Ntβ-LCY過表達轉基因煙草能保持較高的體內(nèi)水含