雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、雞和鵪鶉為家禽生產(chǎn)中的常見(jiàn)物種，雞與鵪鶉同種不同屬，其間雜交屬于禽類中的典型屬間遠(yuǎn)緣雜交，是基因功能研究和比較基因組學(xué)的良好資源；而雞與鵪鶉雜交種在孵化過(guò)程中大量死亡，已有研究表明雜交種胚胎的死亡與胚胎組織器官發(fā)育不完全和性分化相關(guān)，而在胚胎發(fā)育、性別分化過(guò)程中參與的基因和信號(hào)通路眾多。本研究對(duì)雌、雄雞和雌、雄雜交種數(shù)字基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析篩選出與胚胎發(fā)育、性別分化相關(guān)基因，構(gòu)建基因過(guò)表達(dá)載體和 RNA干擾載體，以雞胚細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)

2、材料，調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)量，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)變化，探索目標(biāo)基因在表達(dá)異常時(shí)對(duì)胚胎發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究雌性雜交種胚胎早期死亡的原因奠定基礎(chǔ)。
　　1.對(duì)雌雄雞與雌雄雜交種 DGE庫(kù)通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選與胚胎發(fā)育、性分化相關(guān)顯著富集的信號(hào)通路，如 MPKA、Hedgehog、Wnt、Notch等；表達(dá)差異顯著的相關(guān)基因 FGF8、DACH、LFNG、SOX1、SOX2、SHH、FOXL2、GPR149、CCND

3、1。
　　2.差異基因 FGF8、SHH、FOXL2過(guò)表達(dá)載體和干擾載體的構(gòu)建，參照 NCBI上公布的原雞 FGF8、SHH基因 mRNA序列，在基因編碼區(qū)分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)引物，以 pEGFP-C2為載體，構(gòu)建雞 FGF8和 SHH基因過(guò)表達(dá)載體；經(jīng)菌液 PCR、酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。根據(jù) NCBI上公布的原雞 FGF8、SHH和 Foxl2基因的 mRNA序列，分別依據(jù)基因編碼區(qū)特點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì) shRNA干擾引物

4、，以 pmiRZip為載體，構(gòu)建靶向 FGF8、SHH、Foxl2基因干擾載體；經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，干擾載體構(gòu)建成功。
　　構(gòu)建成功的 FGF8、SHH過(guò)表達(dá)載體和 FGF8、SHH、Foxl2干擾載體轉(zhuǎn)染雞胚細(xì)胞，驗(yàn)證表達(dá)載體和干擾載體效果。
　　3.分析 FGF8、SHH、Foxl2基因?qū)ε咛グl(fā)育的影響，分別將 FGF8、SHH、FOXL2基因表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染雞胚細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：當(dāng) FGF8基因表達(dá)量發(fā)生

5、變化時(shí)，在 MAPK信號(hào)通路中，細(xì)胞間的鏈接蛋白 Grb2表達(dá)水平降低，進(jìn)而影響后續(xù)一系列信號(hào)傳遞與通路的激活，使胚胎不能正常生長(zhǎng)發(fā)育。在 Hedgehog信號(hào)通路中，干擾 SHH基因的表達(dá)時(shí) Hedgehog信號(hào)通路不能夠被激活而處于抑制狀態(tài)，使胚胎早期不能夠正常發(fā)育，當(dāng) SHH基因過(guò)表達(dá)時(shí)，能夠成功激活 Hedgehog信號(hào)通路，并且過(guò)度激活，同樣對(duì)胚胎產(chǎn)生負(fù)面影響，例如胚胎出現(xiàn)畸形。干擾 Foxl2基因使其表達(dá)量降低，造成胚胎發(fā)育