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文檔簡介
1、目的:脫落酸(abscisic acid,ABA)在植物抗逆境脅迫反應(yīng)中起著廣泛而重要的作用,干旱、高鹽和低溫脅迫均能引起植物內(nèi)源ABA水平的提高。因此,近些年來對(duì)于ABA在植物適應(yīng)逆境脅迫中的作用的研究備受關(guān)注。而研究ABA合成過程中的關(guān)鍵酶,通過基因工程來調(diào)控植物體內(nèi)的內(nèi)源ABA的生物合成,已經(jīng)成為提高植物抗逆性的一個(gè)重要途徑。生物化學(xué)和遺傳學(xué)的證據(jù)表明由9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxy carotenoid
2、 dioxygenase,NCED)所催化的氧化裂解反應(yīng)是高等植物ABA合成途徑中的關(guān)鍵步驟。前人的大量研究表明NCED基因受逆境脅迫的誘導(dǎo),其表達(dá)產(chǎn)物能夠調(diào)控逆境條件下ABA的生物合成。到目前為止尚未見到棉花中NCED基因的克隆和研究的相關(guān)報(bào)道,因此本研究期望通過了解棉花9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因在干旱脅迫下的生物學(xué)功能從而為解決棉花逆境脅迫提供理論依據(jù)。
方法:本研究以棉花(晉13)幼苗葉片為材料,
3、根據(jù)ncbi上已經(jīng)登錄的NCED基因的同源序列設(shè)計(jì)簡并引物,用RT-PCR結(jié)合RACE以及巢式PCR的方法,分別克隆到了兩個(gè)編碼NCEDs的基因GhNCED1和GhNCED2全長,并利用半定量RT-PCR分析了兩個(gè)基因在干旱脅迫下的空間表達(dá)水平,同時(shí)利用HPLC的方法測(cè)定干旱脅迫下棉花葉片中內(nèi)源ABA的變化。
結(jié)果:1根據(jù)ncbi上已經(jīng)登錄的NCED基因的同源序列設(shè)計(jì)簡并引物,用RT-PCR結(jié)合RACE以及巢式PCR的方法
4、,從干旱脅迫的棉花葉片中分別克隆了兩個(gè)與抗旱相關(guān)的GhNCED1和GhNCED2基因的全長。GhNCED1的cDNA全長由2125bp組成,其中5’非編碼區(qū)15bp,3’非編碼區(qū)283bp,開放閱讀框架為1827bp,編碼609個(gè)氨基酸,分子量為67.89KDa,等電點(diǎn)為5.94;GhNCED2基因cDNA序列全長為2134bp,其中包括5’端13bp和3’端327bp的非編碼區(qū)和1794bp的開放閱讀框,最后以polyA結(jié)尾,開放閱讀
5、框編碼598個(gè)氨基酸,分子量為66.72KDa,等電點(diǎn)為6.85。分別對(duì)這兩個(gè)基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),GhNCED2與已經(jīng)報(bào)道的NCED家族基因的第一類一樣,N-末端有一個(gè)典型的由30個(gè)氨基酸組成的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽; 而在GhNCED1上則沒有發(fā)現(xiàn)。
2.利用半定量RT-PCR技術(shù),對(duì)干旱脅迫下棉花GhNCED1和GhNCED2基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,GhNCED1基因在未脅迫材料的根、莖、葉中均有表達(dá),且在干
6、旱脅迫下其表達(dá)量并未發(fā)生明顯變化;GhNCED2基因在未脅迫的條件下的莖和葉中少量表達(dá),在根中并不表達(dá),但在干旱脅迫下的莖和葉中高度表達(dá),而根中仍只有少量表達(dá)。
3.利用HLPC方法測(cè)定干旱脅迫下棉花幼苗葉片中的ABA含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下其含量的變化呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì),這與GhNCED2表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致,只是ABA的積累要稍稍落后于GhNCED2的表達(dá)。
結(jié)論:本研究結(jié)合RT-PCR,R
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