棉花杜松烯合成酶基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要的外源抗蟲基因——Bt基因?qū)[翅目害蟲如棉鈴蟲、紅鈴蟲有著良好的抗性。但是隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大面積推廣和多年的田間應(yīng)用,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)由于殺蟲劑用量下降,近些年來導(dǎo)致蚜蟲、綠盲椿象、棉粉虱等非主要害蟲的為害加重。另外,棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)中最重要的病害,嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量。黃萎病致病機(jī)理復(fù)雜,研究進(jìn)展緩慢,育種效率較低,目前尚缺乏高抗品種。在棉花色素腺體中有棉酚等次生代謝物的沉積,它們對棉田中的多種害蟲以及棉花病害均有

2、良好的抗性。因此通過基因工程對棉酚的次生代謝過程進(jìn)行有效地調(diào)控來提高棉酚的含量,具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
　　 杜松烯合成酶催化法呢基焦磷酸(FPP)環(huán)化形成(+)-δ-杜松烯,這是棉酚合成途徑中的限速反應(yīng)。(+-δ-杜松烯是所有棉酚及其衍生物的共同前體物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)從陸地棉Y18R中克隆了杜松烯合成酶基因(Cdn)并分析了其cDNA和基因組序列。Cdn基因的基因組序列為2700bp,具有6個(gè)內(nèi)含子,剪切后其轉(zhuǎn)錄本為1665bp

3、,編碼554個(gè)氨基酸殘基。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有萜類合成酶(環(huán)化酶)的保守活性區(qū)域——DDXXD。蛋白進(jìn)化樹分析表明,此基因?qū)儆诙潘上┖铣擅窩亞家族成員。應(yīng)用Overlap PCR方法將Cdn基因上的2個(gè)HindⅢ酶切位點(diǎn)鈍化,但不改變其編碼的氨基酸序列。
　　 將Cdn基因連接到表達(dá)載體pBI121上,由組成型啟動(dòng)子CaMV35S和綠色組織特異性啟動(dòng)子Psbp分別驅(qū)動(dòng)其表達(dá),成功構(gòu)建了2個(gè)植物表達(dá)載體pGBI-CaMV35S-

4、Cdn和pGBI-Psbp-Cdn。另外還應(yīng)用Gateway法構(gòu)建了一個(gè)RNAi干擾載體pK7GWIWG2(Ⅰ),0-571。構(gòu)建好的3個(gè)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花下胚軸并進(jìn)行組織培養(yǎng),分別獲得了9個(gè)35S轉(zhuǎn)基因(pGBI-CaMV35S-Cdn)愈傷系和小苗、2個(gè)P轉(zhuǎn)基因(pGBI-Psbp-Cdn)愈傷系和小苗、4個(gè)R轉(zhuǎn)基因(pK7GWIWG2(Ⅰ),0-571)愈傷系。
　　 Real-Time PCR分析發(fā)現(xiàn)愈傷系中3

5、5S-1至35S-7的Cdn基因mRNA表達(dá)量是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.97-9.64倍；35S-8和35S-9表達(dá)量分別是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.88和3.34倍。P-1和P-2中Cdn基因mRNA表達(dá)量分別是對照的1.33和1.28倍。說明通過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化,Cdn基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量均有所增加。R-1至R-4的Cdn基因的mRNA表達(dá)量分別是對照的0.43、0.49、0.55和0.41倍。說明經(jīng)過RNAi干擾,Cdn基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量明顯被

6、抑制。
　　 對各愈傷組織系進(jìn)行棉酚含量的測定,35S-1至35S-7愈傷組織中的棉酚含量分別為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?61％-186％；35S-8和35S-9愈傷組織中的棉酚含量分別為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?41％-149％。P1和P2愈傷組織中棉酚含量分別為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?32％和118％。R系愈傷組織中棉酚含量分別為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?6％、108％、109％和92％。由此可以看出,在愈傷組織中,35S系和P系轉(zhuǎn)基因愈傷中的棉酚含量均高于非轉(zhuǎn)

7、基因?qū)φ?而R系的棉酚含量與對照十分接近,沒有如預(yù)期中的明顯降低。結(jié)合前面的愈傷系中Cdn基因mRNA表達(dá)量的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)Cdn基因mRNA表達(dá)量與棉酚含量的提高有著一定的正相關(guān)性,Cdn基因表達(dá)量越高,棉酚含量也會(huì)相應(yīng)提高。但是R系中Cdn基因mRNA表達(dá)量較對照降低了50％左右,但是其棉酚含量卻與對照基本一致,沒有隨著其Cdn基因mRNA表達(dá)量的下降而顯著降低,推測可能是由于Cdn基因亞家族的冗余互補(bǔ)造成的。
　　 棉酚的形成

8、是一個(gè)累積的過程,苗期的棉酚含量普遍高于愈傷組織階段。在苗期,35S系中35S-1至35S-7的棉酚含量高于對照17％-38％,35S-8和35S-9系的棉酚含量高于對照16％和7％；P系中P1和P2的棉酚含量分別高于對照12％和17％。愈傷組織誘導(dǎo)成苗后,小苗35S系和P系中的棉酚含量雖然仍高于對照,但差距在減小。盡管P系中的棉酚含量與對照的差距也在縮小,但下降幅度比35S系要低。初步判斷,在苗期綠色組織特異性啟動(dòng)子Psbp的啟動(dòng)效率

9、逐漸提高。
　　 褐化的愈傷組織中棉酚含量比對應(yīng)的正常愈傷組織中的要略高一些,但無顯著提高。比較35S系、P系、R系及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏某鲇?發(fā)現(xiàn)三種轉(zhuǎn)基因系的出愈率彼此之間并無很大的差別,均在85％-90％之間,而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏某鲇蕿?7％,說明農(nóng)桿菌侵染這一過程可能會(huì)降低棉花組培時(shí)的出愈率。而此時(shí)棉酚含量對棉花組培時(shí)出愈率的影響并不大。在愈傷組織逐漸成苗的階段,會(huì)出現(xiàn)一些玻璃苗,檢測發(fā)現(xiàn)對照玻璃苗中的棉酚含量略高于正常苗5％