雪柑實生苗生理生化及基因和microRNA表達對缺硼的響應.pdf

1、柑橘為亞熱帶果樹，土壤淋溶、硼（B）固定、氮磷鈣施用不協(xié)調(diào)及氣候等原因致使我國柑橘主產(chǎn)區(qū)常出現(xiàn)不同程度的缺硼現(xiàn)象。本研究以缺硼（0μM H3BO3）和對照（10μM H3BO3）處理15周的雪柑實生苗為試驗材料，通過沙培試驗研究了（1）缺硼對雪柑實生苗生長和根葉生理生化的影響，（2）缺硼脅迫下雪柑根和葉基因的差異表達，（3）缺硼脅迫下雪柑根和葉miRNA差異表達，旨在從生理生化和分子水平闡明柑橘耐缺硼的機制，為柑橘高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供科學依

2、據(jù)。
　　1、缺硼對雪柑實生苗生長的影響
　　在10μM H3BO3處理下，雪柑實生苗生長正常，不顯示任何缺硼癥狀，葉片的硼含量介于柑橘葉片硼足夠范圍（30–100μg g-1 DW），而0μM B處理降低植株根莖葉干重（DW）及根葉硼含量；0μM B處理葉片中的硼濃度遠低于柑橘葉片足夠硼的范圍，且0μM B處理雪柑葉片顯示出典型的缺硼癥狀，基于這些結(jié)果，0μM B處理被認為缺硼，10μM B處理被認為硼充足（對照）。

3、>　　2、缺硼對雪柑根葉生理生化的影響
　　處理15周后，研究缺硼對氣體交換，碳水化合物、有機酸、氨基酸、可溶性總蛋白、總酚含量及有機酸和氨基酸代謝過程中相關(guān)酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)缺硼葉片有較多的碳水化合物和較低的 CO2同化，可能是碳水化合物對光合作用的反饋抑制作用。缺硼提高了葉片呼吸速率、大部分有機酸（蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸）含量及參與糖酵解、三羧酸（TCA）循環(huán)、回補途徑的酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化

4、酶、NAD-蘋果酸脫氫酶、NAD-蘋果酸酶、NADP-蘋果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶）活性。總游離氨基酸含量和相關(guān)代謝酶（NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶）活性在缺硼葉片中也增強。反之，呼吸速率、非結(jié)構(gòu)碳水化合物、有機酸（蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸）及氨基酸含量在缺硼根系中減少，參與糖酵解、TCA循環(huán)、回補途徑的大部分代謝酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧

5、化酶、NADP-蘋果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NAD-異檸檬酸脫氫酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶]和氨基酸代謝酶（硝酸還原酶、NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰胺合成酶]活性也相應降低。但是根系和葉片中的總酚（可溶性總蛋白）含量均增加（降低）。總之，呼吸作用、有機酸代謝、回補途徑和氨基酸合成在非結(jié)構(gòu)碳水化合物累積的缺硼葉片中增強，以消耗過量的碳源，在根系中降低以

6、保持碳平衡。
　　3、雪柑根葉缺硼響應基因分離與鑒定
　　應用 cDNA-AFLP，從缺硼葉片（根系）中分別分離出了54（38）個基因表達上調(diào)，和38（45）個基因下調(diào)表達，這些差異基因功能主要涉及蛋白和氨基酸代謝、碳水化合物和能量代謝、核酸代謝、細胞轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導和逆境響應。這些基因中大部分都是只從根系或葉片中分離獲得，只有7個（XP_006484536.1、XP_006488862.1、XP_007042812.1、XP

7、_007043058.1、NP_564354.1、XP_006492455.1
　　和BAF01964.1）相同的基因在根系和葉片中具有相同的基因庫注釋 ID號，其中有三個（XP_006484536.1、NP_564354.1和XP_006492455.1）基因在根葉中的表達趨勢一致以響應缺硼脅迫。顯然，缺硼脅迫下根系和葉片中的基因表達呈現(xiàn)出巨大的差異性。比如：UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferases,

8、 UGTs）的表達在缺硼根系中上調(diào)，在缺硼葉片中被下調(diào)；然而，ATP合成酶在前者被上調(diào)，但在后者不受影響。所有參與信號轉(zhuǎn)導的缺硼響應基因在根系中被下調(diào)，但在缺硼葉片中，除一個基因外，其余差異基因均被上調(diào)。在缺硼葉片中，除一個基因外，所有與泛素化和蛋白水解有關(guān)的基因均被誘導；然而在缺硼根系中，僅發(fā)現(xiàn)了二個與泛素化有關(guān)基因的表達被下調(diào)。參與逆境防御的基因在缺硼根系中被下調(diào)，但在缺硼葉片中除一個基因外，其余差異基因表達均被上調(diào)。
　　4

9、、雪柑根系缺硼響應microRNAs分離及鑒定
　　通過Illumina測序，本研究從缺硼根系中分離了52個（40個保守和12個未知）上調(diào)表達的和82個（72個保守和10個未知）下調(diào)表達的 miRNAs，表明了根系具有巨大的代謝靈活性，這可能有助于植株的耐缺硼性。MiRNAs可能通過以下幾個方面來調(diào)節(jié)根系對缺硼的適應性：（a）上調(diào)miR474表達，下調(diào)miR782和miR843表達，激活防御反應、ROS信號和清除；（b）降低miR

10、5023以增加側(cè)根數(shù)量，增強miR394表達量以保持有利于缺硼適應的表型；（c）降低miR830、miR5266和miR3465表達，增強細胞運輸；（d）改善滲透調(diào)節(jié)（miR474），調(diào)節(jié)其它代謝反應（miR5023和miR821)；（e）增強根系中miR472和miR2118表達，降低與疾病抵抗相關(guān)靶基因表達，從而降低根系的抗病性。
　　5、雪柑葉片缺硼響應microRNAs分離及鑒定
　　通過Illumina測序，本研究

11、從缺硼和正常供硼葉片中各分離出91個（83個保守和8個未知）上調(diào)表達的和81個（75個保守和6個未知）下調(diào)表達的miRNAs，表明了缺硼大大地改變了miRNAs表達，這可能有利于柑橘對缺硼的適應性。葉片 miRNAs對缺硼的適應性可能主要有以下幾個方面：（a）通過改變miR393、miR160和miR3946的表達，降低TIR1水平和ARF介導的基因表達，從而抑制生長素信號，弱化植株生長和發(fā)育，因而增強植物脅迫耐受性；（b）下調(diào)miR1

12、59、miR782、miR3946和miR7539，上調(diào)MYBs表達，維持適宜的葉片表型，增強植物脅迫抵抗能力；（c）下調(diào)miR164、miR6260、miR5929、miR6214、miR3946和miR3446轉(zhuǎn)錄水平，活化脅迫響應和抗氧化系統(tǒng)；（d）增強 miR5037表達，降低主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族（MFS）基因轉(zhuǎn)錄水平，從而減弱硼從植物運出；（e）下調(diào) miR408，調(diào)節(jié)銅平衡、增強超氧化物岐化酶（SOD）活性，參與植物耐缺硼