水貂多重感染的病原學分析及綠膿桿菌松花粉多糖佐劑滅活苗的研制.pdf

1、近幾年，由多種病原共作用引起的水貂多重感染頻繁出現(xiàn)，其發(fā)病原因復雜，臨床癥狀不典型，給水貂疫病的預防和治療帶來極大的困難，也是制約當前水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關鍵因素。所以，本研究對實驗室2010年3月至2014年2月接診的山東地區(qū)的241份發(fā)病貂和病死貂進行了病原學檢測和鑒定，并對主要病原菌綠膿桿菌的生物學特性做了進一步研究，制備了以松花粉多糖為佐劑的全菌體滅活苗。
　　研究內(nèi)容包括以下三個部分:
　　第一部分水貂多重感染的病原學

2、分析
　　為了掌握引起水貂多重感染的主要病原及其特點，本研究分別從細菌性病原和病毒性病原兩個方面對接診的病死貂進行了病原學的分離鑒定。細菌性病原主要是通過染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗和16SrRNA基因序列同源性分析來進行分離鑒定;病毒性病原則主要通過雞胚接種，以及對主要病毒的特異性PCR產(chǎn)物進行序列進化分析等方法進行分離鑒定。結果表明山東地區(qū)引起水貂發(fā)病的主要病原有:犬瘟熱病毒(25.3％)、細小病毒(25.3％)、阿留申病毒(

3、19.1％)、綠膿桿菌(49.0％)、克雷伯氏菌(19.9％)、大腸桿菌(11.2％)、奇異變形桿菌(8.3％)、以及巴氏桿菌(5.0％)和肺炎雙球菌(2.5％)。對主要病原進行系統(tǒng)性統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)水貂感染主要以病原的單獨感染(46.0％)和二重感染(44.4％)為主，三重感染(7.9％)次之，四重感染(1.24％)和五重感染(0.41％)較少。
　　第二部分主要病原綠膿桿菌的生物學特性分析
　　從上述病死貂的病原學

4、檢測結果可知，綠膿桿菌是引起山東地區(qū)水貂多重感染的主要病原菌。為了迸一步了解其生物學特性，本研究對其進行了免疫型鑒定，以確定主要流行菌株的免疫型，并對其進行了藥物敏感性檢測，來確定各免疫型菌株對藥物敏感性的差異及其敏感藥物，還對各免疫型菌株的LD50進行了測定，來比較各免疫型菌株的毒力強弱。結果顯示:118株綠膿桿菌分為3種免疫型:G型(89/118)、B型(21/118)和Ⅰ型(3/118);118株綠膿桿菌的藥物敏感性試驗結果顯示，

5、受試的12種常用抗菌藥物中，對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和阿米卡星的敏感性較高;對阿莫西林、林可霉素和利福平耐藥，而且對抗生素的敏感性與菌株的免疫型無明顯關系;經(jīng)動物試驗證明，3種免疫型菌株毒力均不同，B型和Ⅰ型菌株毒力均較G型弱，G、B和Ⅰ免疫型菌株的LD50分別為:8×106 cfu、4.5×107 cfu、2.5×108 cfu。
　　第三部分綠膿桿菌松花粉多糖佐劑滅活苗的研制
　　從以上試驗結果可知，G免疫型綠膿桿

6、菌是引起水貂多重感染的主要病原，本實驗室多年的研究結果顯示，松花粉多糖具有很好的免疫調(diào)節(jié)和殺菌消毒作用。所以，本研究以松花粉多糖為佐劑，制備了G免疫型綠膿桿菌的全菌體滅活苗。試驗將24只7周齡清潔級小白鼠，均分為3組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，Ⅰ組注射綠膿桿菌全菌體白油司班佐劑滅活苗;Ⅱ組注射添加松花粉多糖佐劑的綠膿桿菌全菌體滅活苗;Ⅲ組注射相同劑量的生理鹽水。在免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d，分

7、別對三組實驗小鼠進行采樣，用建立的ELISA方法檢測采集的血清抗體效價，用全血分析法來檢測淋巴細胞比率，用MTT法來檢測外周血T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，用IL-2 ELISA試劑盒來檢測IL-2的含量。結果顯示:松花粉多糖佐劑綠膿桿菌全菌體滅活苗安全性良好，最佳免疫劑量為0.3ml，免疫保護率為90％，Ⅱ組各免疫指標均顯著高于其他兩組(P＜0.05)，表明本研究制備的松花粉多糖佐劑綠膿桿菌全菌體滅活苗對G型綠膿桿菌流行菌株具有很好的預防作用。