中華稻蝗金屬應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因OcMTF-1的分子特性及功能研究.pdf

1、中華稻蝗Oxya chinensis廣泛分布于我國水稻種植區(qū)，是水稻產(chǎn)區(qū)重要農(nóng)業(yè)害蟲之一。隨著重金屬污染農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，中華稻蝗的生存環(huán)境和取食作物也受到重金屬污染，環(huán)境中重金屬可通過食物鏈在其體內(nèi)累積，并對其生理代謝造成影響。金屬應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子-1（metal-responsive transcription factor-1, MTF-1）是一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，可在機(jī)體應(yīng)對重金屬、低氧或氧化壓力環(huán)境時(shí)發(fā)揮作用。本文克隆獲得中華稻蝗

2、MTF-1基因，進(jìn)而系統(tǒng)地研究了其分子特性和在重金屬鎘誘導(dǎo)條件下對MT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，為進(jìn)一步探索OcMTF-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。本文主要研究內(nèi)容如下：
　　一、中華稻蝗OcMTF-1的分子特性及表達(dá)分析
　　基于中華稻蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索到MTF-1 cDNA片段，采用RACE方法克隆獲得中華稻蝗 MTF-1 cDNA全長序列，命名為 OcMTF-1（ GenBank登錄號(hào)：KM017748），其長為1

3、834 bp，其中開放式閱讀框（ORF）為1527 bp，編碼508個(gè)氨基酸。利用不同生物信息學(xué)軟件對所得序列進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該序列只含有6個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，無其他激活域。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，OcMTF-1 N端的鋅指結(jié)構(gòu)域與目前已知的其他昆蟲的MTF-1有很高的相似度。根據(jù)該基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性表達(dá)引物，利用RT-qPCR方法研究其在中華稻蝗不同組織部位及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OcMTF-1在中華稻蝗馬氏管

4、中高表達(dá)，其次是后腸和脂肪體，其他組織部位表達(dá)量相對較低；在1?5齡若蟲期和成蟲期均表達(dá)。
　　二、中華稻蝗OcMTF-1基因的功能研究
　　以一定濃度的鎘溶液培養(yǎng)麥苗喂食2齡中華稻蝗，直至生長到成蟲第10天，采用RT-qPCR技術(shù)分析了鎘慢性誘導(dǎo)后OcMTF-1、OcMT1和OcMT2的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，慢性鎘處理中華稻蝗后，只有OcMT1表達(dá)量與對照組相比顯著提高，約為對照組的10倍以上，而OcMTF-1和OcMT2的

5、表達(dá)量與對照相比無顯著變化。該結(jié)果與數(shù)字基因表達(dá)譜結(jié)果一致。
　　采用RNAi技術(shù)研究中華稻蝗OcMTF-1基因在生長發(fā)育過程中的功能。RNA干擾研究表明：取4齡若蟲第4天注射OcMTF-1雙鏈RNA，與對照組相比，注射dsRNA24 h和48 h后，OcMTF-1沉默效率分別為72.3％和73.6%，OcMTF-1基因表達(dá)下調(diào)后并不影響蟲體的正常生長發(fā)育。
　　采用RNAi技術(shù)結(jié)合急性鎘處理來進(jìn)一步研究OcMTF-1基因的

6、生物學(xué)功能。與對照組相比，OcMT1在急性鎘誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯上調(diào)，然而將OcMTF-1沉默后再對中華稻蝗進(jìn)行鎘處理，OcMT1表達(dá)量顯著下降，說明中華稻蝗OcMT1的表達(dá)依賴于OcMTF-1；OcMT2在僅注射鎘溶液和OcMTF-1沉默后再進(jìn)行鎘誘導(dǎo)這兩種情況下，其表達(dá)量與對照相比均無明顯變化，表明OcMTF-1可能并不參與調(diào)控OcMT2的表達(dá)。
　　為進(jìn)一步確定中華稻蝗OcMTF-1對OcMT1表達(dá)的調(diào)控作用，采用RT-qPCR

7、技術(shù)檢測注射鎘溶液后6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（4 h、8 h、12 h、16h、20h、24h）的OcMTF-1和 OcMT1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，OcMTF-1在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與對照組相比均無明顯變化，而在鎘處理12h后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OcMT1的表達(dá)量與對照相比均顯著上調(diào)。OcMTF-1是否在鎘處理初期對中華稻蝗OcMT1的表達(dá)發(fā)生作用，還需進(jìn)一步研究。
　　三、中華稻蝗MT基因啟動(dòng)子的克隆
　　根據(jù)飛蝗 LmMT1基因組序列特征，