棉花轉(zhuǎn)錄因子基因GhWRKY27a的分離及功能研究.pdf

1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但其產(chǎn)量和品質(zhì)常受干旱、低溫、鹽堿以及病原菌侵染等多種逆境脅迫的影響。為了適應(yīng)和抵御這些逆境脅迫，植物在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中,逐漸形成了一系列復(fù)雜的防御反應(yīng)機(jī)制。其中，轉(zhuǎn)錄因子在這些防衛(wèi)反應(yīng)中起到了十分重要的作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、衰老及物質(zhì)代謝等一系列生理過(guò)程，還廣泛參與植物對(duì)各種生物及非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。然而，相對(duì)于Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，關(guān)于Ⅲ類(lèi)WR

2、KY轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能的研究仍較少。在本研究中，我們從棉花中分離得到一個(gè)Ⅲ類(lèi)WRKY基因，命名為 GhWRKY27a，并對(duì)其在生物和非生物脅迫反應(yīng)中的表達(dá)特性及生物學(xué)功能進(jìn)行了一系列研究。具體結(jié)果如下：
　?。?）GhWRKY27a的cDNA序列全長(zhǎng)為1513bp，包含1068bp的開(kāi)放閱讀框（ORF）、319bp的5'非編碼區(qū)和126bp的3'非編碼區(qū)。ORF編碼一個(gè)含有356個(gè)氨基酸殘基的多肽，預(yù)測(cè)其分子量為40.062kDa

3、，pI值為5.46。氨基酸序列比對(duì)以及聚類(lèi)分析表明，GhWRKY27a屬于第Ⅲ類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明GhWRKY27a定位在細(xì)胞核中。
　?。?）利用PlantCARE和PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GhWRKY27a的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，得到一系列與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。進(jìn)一步對(duì)GhWRKY27a的表達(dá)特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)GhWRKY27a的表達(dá)可受干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫，過(guò)氧化氫（hydrogen perox

4、ide，H2O2）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、乙烯（ethylene，ET）等信號(hào)分子及立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，R. solani）的誘導(dǎo)。
　　（3）利用病毒介導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)，獲得棉花GhWRKY27a沉默植株

5、。通過(guò)對(duì)其進(jìn)行抗旱性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GhWRKY27a的沉默能夠提高植株對(duì)干旱脅迫的耐受力。此外，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化本生煙，獲得GhWRKY27a超表達(dá)植株。GhWRKY27a超表達(dá)植株對(duì)干旱脅迫十分敏感，且超表達(dá)植株的葉片具有較高的失水率。以上結(jié)果表明，GhWRKY27a在植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GhWRKY27a的超表達(dá)能夠抑制轉(zhuǎn)基因植株干旱誘導(dǎo)的ABA累積，且破壞ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。
　　

6、（4）GhWRKY27a超表達(dá)植株接種R. solani后，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有更嚴(yán)重的發(fā)病表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)GhWRKY27a改變了轉(zhuǎn)基因植株中防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)量。由此推測(cè)，GhWRKY27a可能在植物應(yīng)對(duì)R. solani的侵染中起負(fù)調(diào)控作用。
　?。?）在干旱脅迫和R. solani侵染后，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株積累更多的活性氧，且抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平降低。此外，轉(zhuǎn)基因植株降低了對(duì)氧化脅迫的