金屬脅迫下中華稻蝗金屬硫蛋白分子特性及功能研究.pdf

1、快速發(fā)展的工業(yè)化和城市化導(dǎo)致重金屬的污染日益嚴(yán)重，這關(guān)系到人類健康和環(huán)境安全。被重金屬污染的土壤和水體可通過農(nóng)業(yè)灌溉進(jìn)入食物鏈并轉(zhuǎn)移到植物和動(dòng)物體內(nèi)。水稻是我國種植面積最廣的糧食作物，稻田是目前重金屬污染最為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)區(qū)域。
　　金屬硫蛋白（Metallothionein MT），是一類金屬結(jié)合蛋白。自1957年首次在馬腎中發(fā)現(xiàn)以來，研究者們陸續(xù)在不同生物類群中展開了對(duì)MT的研究，所涉及的領(lǐng)域包括生命科學(xué)、物理化學(xué)、應(yīng)用醫(yī)學(xué)和環(huán)境

2、監(jiān)測(cè)等。MT是細(xì)胞內(nèi)一類低分子量、高半胱氨酸含量的蛋白分子，對(duì)具有10個(gè)電子的金屬具有極高的親和力，包括必需金屬（鋅和銅等）和非必需微量元素（鎘和汞等）。MT普遍存在于微生物、植物、動(dòng)物以及人類細(xì)胞中，在金屬代謝中起著重要的作用。近年來，對(duì)昆蟲MT的研究僅限于果蠅、土壤跳蟲、蚊蟲等少數(shù)物種，目前很少見對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲MT分子特性及功能方面的系統(tǒng)研究。
　　中華稻蝗（Oxya chinensis，O. chinensis）是以水稻葉片和莖

3、桿為食的重要農(nóng)業(yè)害蟲，重金屬可通過中華稻蝗取食富集重金屬的水稻植株后在蟲體內(nèi)不同組織中蓄積。本文以重金屬鎘、銅和鋅為脅迫誘導(dǎo)因子，研究重金屬作用下中華稻蝗金屬硫蛋白基因（Oxya chinensis Metallothionein，OcMT）的分子特性和功能以及對(duì)中華稻蝗解毒酶系和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。本文通過深入開展以上研究，對(duì)闡明中華稻蝗金屬硫蛋白基因功能和重金屬解毒機(jī)制具有重要意義。本文主要內(nèi)容如下：
　　1、中華稻蝗金屬硫蛋

4、白的分子特性分析
　　基于中華稻蝗經(jīng)重金屬鎘染毒后構(gòu)建的數(shù)字基因表達(dá)譜，采用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析得到2個(gè)OcMT基因（OcMT1和OcMT2）的全長序列。已知OcMT1分子全長552bp，開放閱讀框?yàn)?23bp，編碼40個(gè)氨基酸殘基；OcMT2分子全長363bp，開放閱讀框?yàn)?95bp，編碼64個(gè)氨基酸殘基；將這2個(gè)MT基因序列與目前已知的其他昆蟲MT序列進(jìn)行比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)OcMT1和OcMT2具有與其他物種MT蛋白類似的氨基

5、酸特征，半胱氨酸（Cys）含量分別為22.5％和25%，這些半胱氨酸在氨基酸分子中以Cys-Cys, Cys-X-Cys, Cys-X-Y-Cys或Cys-X-Y-Z-Cys的結(jié)構(gòu)式存在，這樣的分子組成和特征使半胱氨酸的巰基容易與金屬離子結(jié)合形成M-MT復(fù)合物。
　　2、中華稻蝗金屬硫蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄特性分析
　　采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了金屬硫蛋白基因在中華稻蝗不同發(fā)育階段和不同組織部位mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性，結(jié)果表明

6、：OcMT1和OcMT2均在中華稻蝗卵期轉(zhuǎn)錄水平最高，而在孵化后的整個(gè)發(fā)育時(shí)期穩(wěn)定表達(dá)，且轉(zhuǎn)錄表達(dá)量較卵期低；OcMT1和OcMT2具有不同的組織分布，OcMT1在視葉中表達(dá)最高，而OcMT2在腦中高表達(dá)，其次是脂肪體，表明中華稻蝗2個(gè)OcMT基因在生理功能具有差異性。
　　3、中華稻蝗金屬硫蛋白基因和蛋白功能研究
　　利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步從分子水平研究了OcMT1和OcMT2的功能，中華稻蝗注射雙鏈RNA（dsRNA）

7、48h后，用不同濃度的3種金屬處理試蟲，結(jié)果表明：OcMT1和OcMT2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在63.1-70.9%的有效沉默時(shí)，金屬毒性導(dǎo)致試蟲死亡率增加8.5-16.7%；異源表達(dá)OcMT1和OcMT2蛋白的大腸桿菌在含銅培養(yǎng)基的生長測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明，OcMT1和OcMT2蛋白可增強(qiáng)宿主細(xì)菌對(duì)銅的耐受性；采用熒光光譜法檢測(cè)OcMT1和OcMT2蛋白對(duì)不同金屬的結(jié)合能力，結(jié)果表明，異源表達(dá)OcMT1和OcMT2蛋白均可螯合鎘、銅和鋅3種金屬

8、，且OcMT1與鋅的結(jié)合能力最強(qiáng)，OcMT2與銅的結(jié)合能力最強(qiáng)。
　　4、重金屬對(duì)中華稻蝗解毒酶活性和組織形態(tài)的影響
　　慢性鎘染毒后中華稻蝗體內(nèi)磷酸酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等解毒酶活性普遍上升；鎘毒性可導(dǎo)致中腸、胃盲囊、馬氏管以及圍食膜組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損；慢性鎘染毒后中華稻蝗不同類型血細(xì)胞形態(tài)和組成發(fā)生變化；中華稻蝗經(jīng)鎘、銅、鋅急性染毒后，發(fā)現(xiàn)蟲體脂肪體的脂肪滴直徑變??；馬氏管內(nèi)均出現(xiàn)不同形態(tài)的顆粒物質(zhì)。結(jié)果表明，中