淀粉合成轉錄因子OsWRKYS2基因克隆、功能驗證及表達特性研究.pdf

1、稻米淀粉的形成是影響水稻產量和品質的決定性因素，研究證實，許多淀粉合成酶基因的表達是受到糖信號的誘導，具有代表性的基因是SUSIBA2，它作為一種轉錄激活劑在糖信號轉導途徑中結合在與支鏈淀粉合成有關淀粉合成酶的啟動子上。本研究通過SUSIBA2基因的氨基酸序列在水稻數據庫中同源比對，以水稻（日本晴）幼穗cDNA為模板，利用RT-PCR技術成功獲得了能類似于SUSIBA2的轉錄因子（命名為OsWRKYS2），旨在通過對水稻淀粉合成途徑中重

2、要調控因子OsWRKYS2的克隆、功能驗證及表達特性研究，來闡明該基因在水稻淀粉合成過程中的分子調控機制，最終使其淀粉組成和積累發(fā)生變化，為利用基因工程手段改善稻米品質實現工廠化成為可能，從而推動稻米品質的遺傳和生理性研究。研究結果如下:
　　 1.基于粳、秈稻數據庫比對，成功克隆類似于SUSIBA2的轉錄因子的cDNA序列（命名為:OsWRKYS2），該基因全長為1713bp，含有一個長1712bp的開放閱讀框架（ORF），編

3、碼570個氨基酸(aa)，與Genbank上收錄的SUSIBA2序列比對同源性達60.02％，該基因具有兩個典型的WRKYGQK結構域，其后尾隨一個C2H2的鋅指結構，多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明該基因屬于WRKY家族第Ⅰ組成員。SignalP和PSORT軟件預測該其編碼的蛋白質不具有信號肽，可能定位在線粒體基質中。
　　 2.為了驗證OsWRKYS2基因的功能，用BamHI/SacI兩種內切酶對質粒p3300進行雙酶切，再將

4、用高保真酶擴增獲得的Os WRKYS2基因連接到p3300的位點上，成功構建了OsWRKYS2基因的p3300-Ubi-OsWRKYS2植物表達載體。
　　 3.通過農桿菌介導法將p3300-Ubi-OsWRKYS2載體轉化粳稻中花11和秈稻kasalath，本研究中共轉化了184株，只獲得了28株抗性植株，轉化效率在8％。并收獲了T0代轉基因種子。對獲得轉基因植株進行PCR-Southern檢測，該基因已完全整合到水稻基因組內

5、，且以單拷貝數在水稻中。
　　 4.對連續(xù)培養(yǎng)后收獲的T3代果穗進行了直（支）鏈淀粉含量、淀粉分支酶(SBE)、可溶性淀粉合成酶(SS)和ADPG焦磷酸化酶(AGPP)活性進行檢測，轉入淀粉合成相關轉錄因子OsWRKYS之后，中花11和kasalath直鏈淀粉含量比野生型分別增加了4.96％和4.73％，支鏈淀粉含量較野生型也有明顯增加，ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶活性均表現高于野生型，其中淀粉分支酶(SBE