淀粉合成轉(zhuǎn)錄因子OsWRKYS2基因克隆、功能驗(yàn)證及表達(dá)特性研究.pdf

1、稻米淀粉的形成是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的決定性因素，研究證實(shí)，許多淀粉合成酶基因的表達(dá)是受到糖信號(hào)的誘導(dǎo)，具有代表性的基因是SUSIBA2，它作為一種轉(zhuǎn)錄激活劑在糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中結(jié)合在與支鏈淀粉合成有關(guān)淀粉合成酶的啟動(dòng)子上。本研究通過SUSIBA2基因的氨基酸序列在水稻數(shù)據(jù)庫中同源比對(duì)，以水稻（日本晴）幼穗cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)成功獲得了能類似于SUSIBA2的轉(zhuǎn)錄因子（命名為OsWRKYS2），旨在通過對(duì)水稻淀粉合成途徑中重

2、要調(diào)控因子OsWRKYS2的克隆、功能驗(yàn)證及表達(dá)特性研究，來闡明該基因在水稻淀粉合成過程中的分子調(diào)控機(jī)制，最終使其淀粉組成和積累發(fā)生變化，為利用基因工程手段改善稻米品質(zhì)實(shí)現(xiàn)工廠化成為可能，從而推動(dòng)稻米品質(zhì)的遺傳和生理性研究。研究結(jié)果如下:
　　 1.基于粳、秈稻數(shù)據(jù)庫比對(duì)，成功克隆類似于SUSIBA2的轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列（命名為:OsWRKYS2），該基因全長為1713bp，含有一個(gè)長1712bp的開放閱讀框架（ORF），編

3、碼570個(gè)氨基酸(aa)，與Genbank上收錄的SUSIBA2序列比對(duì)同源性達(dá)60.02％，該基因具有兩個(gè)典型的WRKYGQK結(jié)構(gòu)域，其后尾隨一個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該基因?qū)儆赪RKY家族第Ⅰ組成員。SignalP和PSORT軟件預(yù)測(cè)該其編碼的蛋白質(zhì)不具有信號(hào)肽，可能定位在線粒體基質(zhì)中。
　　 2.為了驗(yàn)證OsWRKYS2基因的功能，用BamHI/SacI兩種內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒p3300進(jìn)行雙酶切，再將

4、用高保真酶擴(kuò)增獲得的Os WRKYS2基因連接到p3300的位點(diǎn)上，成功構(gòu)建了OsWRKYS2基因的p3300-Ubi-OsWRKYS2植物表達(dá)載體。
　　 3.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p3300-Ubi-OsWRKYS2載體轉(zhuǎn)化粳稻中花11和秈稻kasalath，本研究中共轉(zhuǎn)化了184株，只獲得了28株抗性植株，轉(zhuǎn)化效率在8％。并收獲了T0代轉(zhuǎn)基因種子。對(duì)獲得轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR-Southern檢測(cè)，該基因已完全整合到水稻基因組內(nèi)

5、，且以單拷貝數(shù)在水稻中。
　　 4.對(duì)連續(xù)培養(yǎng)后收獲的T3代果穗進(jìn)行了直（支）鏈淀粉含量、淀粉分支酶(SBE)、可溶性淀粉合成酶(SS)和ADPG焦磷酸化酶(AGPP)活性進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)入淀粉合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsWRKYS之后，中花11和kasalath直鏈淀粉含量比野生型分別增加了4.96％和4.73％，支鏈淀粉含量較野生型也有明顯增加，ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶活性均表現(xiàn)高于野生型，其中淀粉分支酶(SBE