落葉松IAA受體基因分離與干細(xì)胞極性相關(guān)miR166及其目標(biāo)基因功能研究.pdf

1、落葉松(Larix spp.)是我國(guó)北方和西部高山地區(qū)具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的針葉樹(shù)種，而體細(xì)胞胚再生體系是進(jìn)行落葉松分子遺傳改良的基礎(chǔ)，也是研究裸子植物胚胎發(fā)生機(jī)制的理想實(shí)驗(yàn)材料。受基因型和培養(yǎng)條件的影響，落葉松體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)經(jīng)常出現(xiàn)發(fā)育畸形，阻礙了實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)。生長(zhǎng)素及其極性運(yùn)輸在擬南芥等植物胚胎的形態(tài)建成中扮演重要角色。已經(jīng)有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子HD-ZIPⅢ可能參與生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸過(guò)程，且HD-ZIPⅢ為miR166的目標(biāo)基因。但是

2、在裸子植物體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程中，miR166調(diào)控HD-ZIPⅢ，及其與生長(zhǎng)素的關(guān)系沒(méi)有相關(guān)研究。以落葉松體細(xì)胞胚為實(shí)驗(yàn)材料，研究了生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑N-1-萘基酞氨酸(NPA)和過(guò)表達(dá)miR166a對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育的影響，分析了2個(gè)生長(zhǎng)素受體和4個(gè)HD-ZIPⅢ家族成員的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，并得到以下結(jié)果:
　　 (1)采用NPA處理，模擬生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸被抑制的突變體，研究生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸對(duì)落葉松體細(xì)胞胚發(fā)育的影響。結(jié)果表明，10

3、mg/L的IAA和3 mg/L的NPA處理導(dǎo)致原胚團(tuán)生長(zhǎng)緩慢，胚性胚柄結(jié)構(gòu)消失。成熟培養(yǎng)基中加入3 mg/L的NPA，體細(xì)胞胚發(fā)育出現(xiàn)畸形，子葉融合不展開(kāi)，頂端呈杯狀，胚柄程序化細(xì)胞凋亡被延緩，且胚頭的生長(zhǎng)受到抑制。利用樹(shù)脂半薄切片觀察體細(xì)胞胚的顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明NPA處理導(dǎo)致體細(xì)胞胚的頂-基胚軸極性無(wú)法正常建立，細(xì)胞排列紊亂，各組織和器官?zèng)]有正確有序的進(jìn)行分化，胚頭和胚柄的生長(zhǎng)平衡被打破。
　　 (2)通過(guò)同源克隆獲得了兩個(gè)生

4、長(zhǎng)素受體基因LaAFB1和LaAFB2，兩者都具有典型的LRR和F-box結(jié)構(gòu)域。LaAFB1的3'端具有miR393結(jié)合位點(diǎn)，其體內(nèi)切割產(chǎn)物通過(guò)RLM-5'RACE技術(shù)得到驗(yàn)證，且切割位點(diǎn)發(fā)生在miR393的第10和13位堿基，表明落葉松LaAFB1受到miR393的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過(guò)檢索體細(xì)胞胚和幼苗的小RNA測(cè)序文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)LaAFB1被切割后能產(chǎn)生次級(jí)siRNA，且只存在于幼苗小RNA文庫(kù)中，而不存在于體細(xì)胞胚的小RNA文庫(kù)中，提示

5、miR393介導(dǎo)LaAFB1切割產(chǎn)生的次級(jí)siRNA只在落葉松的胚后發(fā)育中發(fā)揮功能。采用qRT-PCR檢測(cè)LaAFB1和LaAFB2在落葉松根莖葉等器官和體細(xì)胞胚中的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的表達(dá)規(guī)律相似，且在成熟體細(xì)胞胚中的表達(dá)水平最低，表明削弱生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，有利于胚胎的發(fā)育和成熟。
　　 (3)利用同源克隆和RACE技術(shù)獲得了4個(gè)落葉松HD-ZIPⅢ同源基因的全長(zhǎng)cDNA，分別命名為L(zhǎng)aHDZ31、32、33和34。它

6、們都具有保守的蛋白結(jié)構(gòu)域:HD、START和MEKHLA。在LaHDZ31-34的START中存在miR165/166的核酸互補(bǔ)序列，進(jìn)一步采用RLM-5'RACE驗(yàn)證了LaHD Z33和34的體內(nèi)切割產(chǎn)物，且切割位點(diǎn)均位于miR166的第10位堿基，表明在落葉松體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中，LaHDZ31-34受到miR165/166的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。利用qRT-PCR檢測(cè)了LaHDZ31-34在正常發(fā)生和NPA處理的體細(xì)胞胚中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明

7、LaHDZ31-34在成熟體細(xì)胞胚中的表達(dá)量高于原胚團(tuán)中，且表達(dá)最高峰發(fā)生在后期單胚階段。在體細(xì)胞胚發(fā)育早期，NPA處理的體細(xì)胞胚中LaHDZ31-34的表達(dá)量比對(duì)照高;而在發(fā)育的后期階段，LaHDZ31-33在NPA處理的體細(xì)胞胚中的表達(dá)量比對(duì)照低，但LaHDZ34的表達(dá)不受影響。表明LaHDZ31-34與落葉松體細(xì)胞胚極性的形成密切相關(guān)，LaHDZ34在胚胎發(fā)育后期及子葉形成中的功能與其他3個(gè)基因不同。
　　 (4)通過(guò)qR

8、T-PCR檢測(cè)了miR166的兩個(gè)前體基因LaMIR166a和LaMIR166b在落葉松根莖葉、正常發(fā)生的體細(xì)胞胚和NPA處理的畸形胚中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的表達(dá)模式明顯不同。LaMIR166a在根莖葉中均表達(dá)，且在原胚團(tuán)中的表達(dá)水平比成熟體細(xì)胞胚中略高;而LaMIR166b在原胚團(tuán)和葉中不表達(dá)，在體細(xì)胞胚成熟過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。在體細(xì)胞胚成熟過(guò)程中，miR166及其目標(biāo)基因存在共表達(dá)現(xiàn)象，但是在體細(xì)胞胚發(fā)育后期，LaMIR166a和L

9、aMIR166b的表達(dá)受NPA誘導(dǎo)，其目標(biāo)基因卻受NPA抑制。構(gòu)建Super啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LaMIR166a超表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的落葉松胚性細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了五個(gè)抗性細(xì)胞系。經(jīng)PCR檢測(cè)驗(yàn)證，五個(gè)抗性細(xì)胞系均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因。對(duì)過(guò)表達(dá)LaMIR166a的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞胚的表型和顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)LaMIR166a使胚軸伸長(zhǎng)受到抑制，影響子葉的發(fā)生和莖頂端分生組織的形態(tài)。
　　 過(guò)表達(dá)LaMIR166a與NPA