哈維氏弧菌運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因功能研究.pdf

1、弧菌病(Vibriosis)是一種全球范圍內(nèi)發(fā)生的細(xì)菌性疾病。其中哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是一種水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中非常重要的致病菌,嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康,給海水魚(yú)類、蝦類及其他養(yǎng)殖對(duì)象造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,有關(guān)哈維氏弧菌致病機(jī)理的研究在國(guó)內(nèi)外受到高度重視。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌致病機(jī)理與胞外產(chǎn)物、溶血素等均相關(guān),但有關(guān)其運(yùn)動(dòng)性及運(yùn)動(dòng)在細(xì)菌感染早期的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于運(yùn)動(dòng)在細(xì)菌致病早期的重要作用,本研究以哈維氏弧菌為

2、研究對(duì)象,尋找運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因,試圖揭示運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的功能,初步了解運(yùn)動(dòng)性與致病性之間的相互聯(lián)系,以期對(duì)哈維氏弧菌乃至其它弧菌致病機(jī)制和防治研究提供一定的理論依據(jù)。
　　 本研究從Escherichia coli Sm10(pLOFKm)中攜帶的轉(zhuǎn)座子mini-Tn10的自殺性質(zhì)粒pLOFKm引入受體菌哈維氏弧菌Ts-628菌株中,構(gòu)建突變株庫(kù)。我們從大約3000個(gè)轉(zhuǎn)座突變株中篩選到3株運(yùn)動(dòng)缺陷型菌株。避開(kāi)轉(zhuǎn)座子內(nèi)部酶切位點(diǎn)選用Xb

3、aI酶切突變株的基因組DNA,在連接酶的作用下使基因組DNA的酶切片段環(huán)化,以這些環(huán)化的片段為模板,根據(jù)轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行反向PCR,將反向PCR產(chǎn)物克隆到T載體測(cè)序,獲得轉(zhuǎn)座子側(cè)翼未知基因的部分序列,根據(jù)獲得的序列在基因庫(kù)中尋找同源基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這465bp的側(cè)翼序列表現(xiàn)出與哈維氏弧菌ATCC BAA-1116菌株基因組3612978至3613443序列具有很高的同源性(96.9％),該序列在哈維氏弧菌ATCC BAA-1116菌

4、株中為一個(gè)未知功能的蛋白,此外,該序列還與副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)RIMD2210633菌株基因組中的pgk(磷酸甘油酸激酶)基因具有第二高(91.8％)的同源性。突變株H2反向PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)約950bp,其中356bp為獲得的插入位點(diǎn)側(cè)翼的未知基因序列,該序列經(jīng)過(guò)同源性比較發(fā)現(xiàn)與哈維氏弧菌ATCC BAA-1116菌株基因組3203663至3204019序列的同源性最高(94.6％),與溶藻弧菌(V.alg

5、inolyticus)HY9901菌株鞭毛蛋白基因flaB具有第二高的同源性(92.4％)。鑒定了突變株在生長(zhǎng)、趨化、早期黏附及生物膜形成等方面的生物學(xué)特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變株H1生長(zhǎng)參數(shù)明顯不同于野生株。趨化性測(cè)定顯示,3株突變株均都趨化性減弱。對(duì)野生型和3株突變型菌株早期粘附研究發(fā)現(xiàn),野生型菌株粘附能力均強(qiáng)于3株突變株。對(duì)于生物膜形成研究說(shuō)明野生型菌株形成生物膜的能力強(qiáng)于突變株,而在3株突變株中H2型菌株形成的生物膜的能力最弱。通過(guò)本