水稻直鏈淀粉合成基因OsgbssⅡ的研究.pdf

1、不同直鏈含量的淀粉在食品、醫(yī)療、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等行業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用。水稻在全世界種植面積大，產(chǎn)量高。因此，培育不同直鏈淀粉含量的水稻品種意義重大。水稻中直鏈淀粉合成相關(guān)的基因主要有OsgbssⅠ和OsgbssⅡ兩個(gè)基因，OsgbssⅠ基因主要與胚乳等存儲(chǔ)型器官中直鏈淀粉的合成有關(guān)，研究比較詳細(xì)。而OsgbssⅡ基因主要在莖、葉片等光合組織臨時(shí)性存儲(chǔ)淀粉的器官中合成直鏈淀粉，對(duì)該基因的研究相對(duì)較少，該基因的功能及作用特征還未完全明了。本

2、論文從水稻中克隆并構(gòu)建了OsgbssII基因的植物表達(dá)載體，對(duì)轉(zhuǎn)OsgbssII基因水稻的基因表達(dá)及淀粉含量等表型進(jìn)行了分析，初步結(jié)果如下：
　　1.不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下OsgbssII基因在水稻中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因株系表型
　　對(duì)3個(gè)過表達(dá)載體和1個(gè)反義載體轉(zhuǎn)基因T3代純合株系種子發(fā)育過程中OsgbssII基因表達(dá)定量分析顯示：由胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子SBE IIb驅(qū)動(dòng)的gbssII和玉米Ubi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的gbssII轉(zhuǎn)基因水稻的幼嫩

3、種子中，gbssII基因表達(dá)量在花后6d時(shí)分別是同期對(duì)照的2倍和3倍，12d時(shí)分別是對(duì)照的14倍和23倍，均達(dá)到極顯著差異水平；轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系幼嫩種子中，gbssⅡ基因表達(dá)量在花后6d、12d時(shí)分別是同期對(duì)照的2倍和7倍，顯著高于對(duì)照，但未達(dá)到極顯著差異水平；轉(zhuǎn)Ubi-gbssII株系倒二葉片中g(shù)bssⅡ基因表達(dá)量在花后各時(shí)期均顯著高于Ubi-antigbssⅡ株系和對(duì)照，其中花后6d時(shí)是對(duì)照的5倍，達(dá)到高峰。反義表達(dá)的Ubi

4、-antigbssⅡ株系葉片中g(shù)bssⅡ基因表達(dá)量在各時(shí)期較對(duì)照有所降低，但未達(dá)到顯著差異水平。
　　對(duì)花后3d、6d、12d時(shí)幼嫩種子中直鏈淀粉占總淀粉百分含量的測(cè)定結(jié)果顯示：Ubi-gbssⅡ株系在3d和6d時(shí)較同期對(duì)照分別提高了53.2%、55.5%，達(dá)到極顯著差異水平；IIb-gbssⅡ株系在花后6d時(shí)比對(duì)照提高了41.1%，達(dá)到顯著差異水平；轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系較對(duì)照有所提高，轉(zhuǎn)Ubi-antigbssⅡ株系較對(duì)照有

5、所降低，但都未達(dá)到差異顯著水平。
　　成熟種子中直鏈淀粉含量分析顯示：轉(zhuǎn)IIb-gbssⅡ株系和Ubi-gbssⅡ株系較對(duì)照分別提高2.98%、5.8%，達(dá)到顯著和極顯著差異水平；轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系和Ubi-antigbssⅡ株系較對(duì)照分別提高1.64%和降低1.33%，均未達(dá)到差異顯著水平。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻成熟種子淀粉顆粒形態(tài)分析顯示：轉(zhuǎn)IIb-gbssⅡ、Ubi-gbssⅡ株系的淀粉粒顆粒形態(tài)較對(duì)照小，有明顯的晶

6、體棱角，排列致密；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏牡矸哿Ｓ写?、小兩種不同的顆粒形態(tài)，排列疏松，表面光滑；轉(zhuǎn)Gt1-gbssⅡ株系中大多數(shù)淀粉粒聚合在一起形成簇狀結(jié)構(gòu)，還有少數(shù)淀粉粒游離于簇之間。
　　2.構(gòu)建OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因啟動(dòng)子互換過表達(dá)載體和RNAi干擾載體，進(jìn)一步分析OsgbssⅡ基因的作用。
　　構(gòu)建了OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因啟動(dòng)子互換過表達(dá)載體和RNAi干擾載體3個(gè)，分別是：1301-OsgbssⅠp-

7、OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅠp-OsgbssⅡ，1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ，1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi，并用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分別獲得轉(zhuǎn)基因克隆43個(gè)、46個(gè)和41個(gè)。
　　對(duì)轉(zhuǎn)3個(gè)載體T0代植株的OsgbssⅠ、OsgbssⅡ基因表達(dá)定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-O

8、sgbssⅡp-OsgbssⅠ株系在花后0d、3d、6d、12d時(shí)，倒二葉片中g(shù)bssⅠ基因表達(dá)量分別是同期對(duì)照的25倍、1578倍、625倍、220倍，差異均極顯著；而轉(zhuǎn)另2個(gè)載體株系及對(duì)照葉片中g(shù)bssⅠ基因表達(dá)量在各時(shí)期均幾乎為0；表明OsgbssⅡp啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)了OsgbssⅠ基因在葉片中表達(dá)，同時(shí)表明水稻內(nèi)源OsgbssⅠp啟動(dòng)子不能驅(qū)動(dòng)OsgbssⅠ基因在葉片中表達(dá)。
　　轉(zhuǎn)基因成熟種子中直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果顯示：Osg

9、bssⅡp驅(qū)動(dòng)OsgbssⅠ基因表達(dá)的轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅠ株系成熟種子的直鏈淀粉含量最高，較對(duì)照提高3.58%；OsgbssⅠ、OsgbssⅡ兩個(gè)基因都被干擾的轉(zhuǎn)1301-OsgbssⅠp-OsgbssⅠRNAi-OsgbssⅡp-OsgbssⅡRNAi株系最低，較對(duì)照降低6.91%；均未達(dá)到顯著差異水平。
　　3.構(gòu)建OsgbssⅡ基因原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)