水稻淀粉合成關(guān)鍵酶基因的克隆及分子調(diào)控研究.pdf

1、淀粉是許多糧食作物的種子、馬鈴薯塊莖及多種植物塊根的主要組成成份,在人類生活中起著舉足輕重的作用。開展淀粉合成相關(guān)基因的研究是闡明淀粉合成機(jī)理以及利用基因工程改良淀粉品質(zhì)的基礎(chǔ),具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。本文根據(jù)發(fā)表在GeneBank中的基因序列,設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR方法,從粳稻品種日本晴未成熟種子的cDNA中克隆到完整的水稻淀粉粒結(jié)合型淀粉合成酶(WAXY)蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA及完整的水稻淀粉分支酶3(3, RBE3)蛋白

2、質(zhì)編碼區(qū)cDNA;利用PCR方法從粳稻品種日本晴基因組DNA中克隆到水稻W(wǎng)axy,基因和水稻RBE3基因的片段各一個(gè)。 ⑴克隆的水稻W(wǎng)axy基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)cDNA全長1830bp,編碼610個(gè)氨基酸。編碼序列與已發(fā)表的水稻淀粉粒結(jié)合型淀粉合成酶I蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA序列相比,核酸序列有兩個(gè)核酸的突變,推導(dǎo)的氨基酸序列也有兩個(gè)氨基酸的突變,但沒有影響到蛋白質(zhì)的正?；钚浴乃净蚪MDNA中克隆到的水稻W(wǎng)axy基因片段長

3、206bp,與已發(fā)表序列完全一致。 ⑵克隆的水稻RBE3基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)cDNA全長2478bp,編碼826個(gè)氨基酸。編碼序列與已發(fā)表的水稻RBE3基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA序列相比,核酸序列有兩個(gè)核酸的突變,推導(dǎo)的氨基酸序列也有一個(gè)氨基酸的突變,但沒有影響到蛋白質(zhì)的正?；钚?。從水稻基因組DNA中克隆到的水稻RBE3基因片段長195bp,與已發(fā)表序列完全一致。 ⑶利用獲得的完整水稻W(wǎng)axy基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA

4、及完整的水稻RBE3基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)cDNA,以克隆的谷蛋白A3基因(GluA3)啟動(dòng)子控制基因的表達(dá),構(gòu)建了這兩個(gè)基因的過量植物表達(dá)載體；再根據(jù)siRNA選取原則,選擇了水稻W(wǎng)axy基因及水稻RBE3基因片段,分別以GluA3啟動(dòng)子和高分子量麥谷蛋白基因(HMW)啟動(dòng)子調(diào)控這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄,構(gòu)建了這兩個(gè)基因的siRNA植物表達(dá)載體；構(gòu)建了基因過量表達(dá)和RNAi結(jié)合的多基因表達(dá)載體。 ⑷用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)水稻品種中花11進(jìn)行轉(zhuǎn)