鵝源糞腸球菌efaA基因的克隆表達和生物信息學分析.pdf

1、目的:構(gòu)建鵝源糞腸球菌efaA基因的原核表達載體，在大腸球菌工程菌BL21中表達，對所表達的efaA蛋白進行免疫原性檢測及生物信息學分析。
　　方法:提取糞腸球菌標準株與分離株的總DNA，做擴增模板;登陸GenBank，根據(jù)其公布的糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原的堿基序列，應用PrimerPremier5.0與Oligo6.0軟件設(shè)計一對efaA的特異性引物;摸索PCR擴增條件擴增成功后，進行凝膠電泳分離并回收目的片段;將該片段與pMD18

2、-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞;篩選陽性克隆菌，提取質(zhì)粒，進行PCR和單雙酶切鑒定，確證克隆成功后送公司測序。酶切克隆成功的pMD18-T-efaA重組質(zhì)粒，構(gòu)建pET-28a-efaA重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中;篩選pET-28a-efaA/BL21陽性菌株，分別在不同濃度、時間及溫度條件下誘導表達，確定最佳誘導條件;通過蛋白電泳SDS-PAGE鑒定確證后，用鎳柱純化，得到純化的efaA蛋白。用

3、SDS-PAGE和Westernblot兩種方法鑒定efaA蛋白。對表達的efaA氨基酸序列進行生物信息學分析:根據(jù)對efaA氨基酸組分、分子質(zhì)量、滴定曲線與等電點等分析，預測其一級結(jié)構(gòu)中糖基化位點等，根據(jù)對其可塑性、親水性、抗原性指數(shù)和表面可及性以及β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等的綜合分析，預測潛在抗原表位。
　　結(jié)果:成功克隆了鵝源糞腸球菌菌株心內(nèi)膜炎抗原efaA基因，其堿基序列為726bp，編碼242個氨基酸。成功構(gòu)建了pET-28

4、a-efaA/BL21表達載體，確定最佳誘導條件為，IPTG終濃度1.0mmol/L、溫度28℃、時間4h，所表達的蛋白為30KD，大小與預期一致。SDS-PAGE和Westernblot鑒定，efaA蛋白為30KD，與預期一致。鵝源糞腸球菌efaA蛋白的第13～19、26～33、66～73、92～105、141～149、152～164、190～200、210～260位氨基酸，其親水性指數(shù)＞0、AI≥0、表面可及性＞1，具有β-折疊和無