大乳頭水螅forkhead基因的克隆、生物信息學分析及原核表達.pdf

1、Forkhead蛋白為一種能通過轉錄調控來影響動物的胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、細胞凋亡以及免疫等過程的轉錄因子。近期完成的水螅核基因組測序項目結果顯示,水螅也具有脊椎動物forkhead基因的同源基因。在高等動物中,forkhead蛋白是一種直接參與調控動物胚胎發(fā)育的重要轉錄因子,而水螅forkhead蛋白生理功能目前未知、值得深入研究?；诖?本研究圍繞大乳頭水螅forkhead基因進行了以下實驗工作:
　　1.提取大乳頭水?？?/p>

2、RNA,采用SMART技術制備大乳頭水螅RACE cDNA文庫,再以該文庫為模板擴增了大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列,PCR產物純化后與克隆載體pMD-18T連接,轉化E.coli JM109菌株。運用菌落PCR方法鑒定陽性克隆后進行DNA測序,測序結果表明大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列編碼區(qū)全長序列為963個核苷酸,編碼321個氨基酸。大乳頭水螅forkhead基因cDNA序列的成功克隆為深入探討forkhea

3、d基因的分子進化及水螅forkhead蛋白的生理功能奠定了基礎。
　　2.基于原核表達質粒pET-LT多酶切位點的特點設計引物,以已克隆獲得的pMD18-T-forkhead重組質粒為模板,PCR擴增大乳頭水螅forkhead基因片段(編碼區(qū)cDNA序列的第7位點至963位點),再把該基因片段的PCR產物純化后連接到原核表達質粒pET-LT上,構建重組表達載體pET-LT-forkhead,轉化E.coli BL21(DE3)菌株