龍眼種質資源遺傳多樣性分析及低溫對石硤龍眼影響研究.pdf

1、中國是龍眼主要起源地之一，存在許多性狀優(yōu)良的野生和實生資源，雖然目前對龍眼資源的遺傳多樣性有較多的研究報道，但主要集中于國內栽培品種之間，對國外品種及國內龍眼非栽培資源研究不多。為此，本研究收集了大量野生和實生的龍眼資源，分析其遺傳多樣性，探明其親緣關系，為龍眼資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。近年來，低溫寒凍害造成龍眼大面積死亡的現(xiàn)象時有發(fā)生，給龍眼生產帶來巨大損失。石硤龍眼是我國的主栽品種之一，但低溫對石硤龍眼影響的研究深度不夠。為了更進一步

2、探討低溫對石硤龍眼的影響，本研究從生理生化和分子水平探討低溫脅迫對石硤龍眼的影響，為龍眼栽培和抗寒育種提供依據(jù)。主要研究結論如下：
　　 1、龍眼資源遺傳多樣性分析
　　 利用SCoT和ISSR兩種分子標記技術對國內3個省區(qū)及越南、泰國的龍眼種質資源的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)非栽培資源與栽培品種之間的遺傳距離較遠，中國龍眼基因資源豐富，泰國和越南的基因型龍眼分別聚類于2個不同的遺傳類且遺傳多樣性較低。龍荔和龍眼之間的親

3、緣關系較遠。
　　 2、低溫脅迫對龍眼生理生化特性的影響
　　 以龍眼幼苗為材料，研究低溫脅迫對龍眼生理生化指標的影響。在低溫脅迫期間，各保護酶類、脯氨酸和可溶性蛋白含量呈先上升再下降的趨勢；滲透物質可溶性糖含量一直呈上升趨勢；相對含水量下降，電導率在達到最大值后急劇下降，MDA含量在處理前期處于較高水平；低溫脅迫8小時前，對光合作用的影響以氣孔限制為主，之后以非氣孔限制為主，上述所測定的指標與龍眼低溫脅迫呈顯著或極顯著

4、相關。經主成分分析表明，前3個主成分包括的抗寒評價指標(保護酶類、膜透性和葉綠素熒光參數(shù))可以進行抗寒性分析，可作為龍眼抗寒性評價的依據(jù)。另外，通過綜合分析表明，4℃低溫處理12小時內，可作為龍眼幼苗抗寒鍛煉的適宜條件。
　　 3、龍眼響應低溫脅迫的蛋白質組學分析
　　 建立了龍眼葉片總蛋白雙向電泳體系，從蛋白質水平研究龍眼幼苗對低溫的響應機制。從2-DE圖譜獲得了700多個有效蛋白質點，表達量差異在2倍以上有45個差異

5、蛋白點，其中有36.7%的蛋白上調表達，63.3%的蛋白被下調表達。質譜鑒定出31個蛋白，它們主要是參與光合作用、自由基清除、細胞生長和分裂、信號傳導、蛋白加工和基礎代謝的蛋白。
　　 4、抗寒相關基因的克隆與表達分析
　　 應用RT-PCR和RACE方法克隆了蛋白質組學分析中的光合放氧33 kD蛋白、鋅指蛋白、抗壞血酸過氧化物酶、景天庚酮-1，7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、泛素蛋白、磷酸核酮糖激酶、谷氨酰胺合成酶

6、、熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、14-3-3蛋白、葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶、咖啡酰輔酶A甲基轉移酶、碳酸酐酶、水通道蛋白、鈣依賴型蛋白激酶蛋白基因cDNA全長，并同源克隆了葉綠素a/b結合蛋白1、葉綠素a/b結合蛋白2、葉綠素a/b結合蛋白4和CBF基因cDNA全長。其中10個基因成功在大腸桿菌中表達，獲得相應外源蛋白，并對熱激蛋白經Western-blot驗證確認。利用實時熒光定量技術對獲得的基因進行了低溫脅迫下時空表達模式分析，結

7、果顯示所有的基因在低溫下均發(fā)生變化，但各基因的變化規(guī)律不同，如磷酸核酮糖激酶、泛素蛋白、Rubisco活化酶、谷氨酰胺合成酶、14-3-3蛋白、光合放氧33 kD蛋白、水通道蛋白、葉綠素a/b結合蛋白、碳酸酐酶等基因在低溫脅迫前期的變化較大，可能與各基因參與低溫脅迫時的功能有關。已獲得的cDNA全長中有43.8%在mRNA水平和蛋白水平表達相一致，56.2%的基因在轉錄水平上表達并沒有直接伴隨在蛋白水平的表達。
　　 5、抗寒相