龍眼種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及低溫對石硤龍眼影響研究.pdf

1、中國是龍眼主要起源地之一，存在許多性狀優(yōu)良的野生和實生資源，雖然目前對龍眼資源的遺傳多樣性有較多的研究報道，但主要集中于國內(nèi)栽培品種之間，對國外品種及國內(nèi)龍眼非栽培資源研究不多。為此，本研究收集了大量野生和實生的龍眼資源，分析其遺傳多樣性，探明其親緣關(guān)系，為龍眼資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。近年來，低溫寒凍害造成龍眼大面積死亡的現(xiàn)象時有發(fā)生，給龍眼生產(chǎn)帶來巨大損失。石硤龍眼是我國的主栽品種之一，但低溫對石硤龍眼影響的研究深度不夠。為了更進一步

2、探討低溫對石硤龍眼的影響，本研究從生理生化和分子水平探討低溫脅迫對石硤龍眼的影響，為龍眼栽培和抗寒育種提供依據(jù)。主要研究結(jié)論如下：
　　 1、龍眼資源遺傳多樣性分析
　　 利用SCoT和ISSR兩種分子標記技術(shù)對國內(nèi)3個省區(qū)及越南、泰國的龍眼種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)非栽培資源與栽培品種之間的遺傳距離較遠，中國龍眼基因資源豐富，泰國和越南的基因型龍眼分別聚類于2個不同的遺傳類且遺傳多樣性較低。龍荔和龍眼之間的親

3、緣關(guān)系較遠。
　　 2、低溫脅迫對龍眼生理生化特性的影響
　　 以龍眼幼苗為材料，研究低溫脅迫對龍眼生理生化指標的影響。在低溫脅迫期間，各保護酶類、脯氨酸和可溶性蛋白含量呈先上升再下降的趨勢；滲透物質(zhì)可溶性糖含量一直呈上升趨勢；相對含水量下降，電導率在達到最大值后急劇下降，MDA含量在處理前期處于較高水平；低溫脅迫8小時前，對光合作用的影響以氣孔限制為主，之后以非氣孔限制為主，上述所測定的指標與龍眼低溫脅迫呈顯著或極顯著

4、相關(guān)。經(jīng)主成分分析表明，前3個主成分包括的抗寒評價指標(保護酶類、膜透性和葉綠素熒光參數(shù))可以進行抗寒性分析，可作為龍眼抗寒性評價的依據(jù)。另外，通過綜合分析表明，4℃低溫處理12小時內(nèi)，可作為龍眼幼苗抗寒鍛煉的適宜條件。
　　 3、龍眼響應(yīng)低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學分析
　　 建立了龍眼葉片總蛋白雙向電泳體系，從蛋白質(zhì)水平研究龍眼幼苗對低溫的響應(yīng)機制。從2-DE圖譜獲得了700多個有效蛋白質(zhì)點，表達量差異在2倍以上有45個差異

5、蛋白點，其中有36.7%的蛋白上調(diào)表達，63.3%的蛋白被下調(diào)表達。質(zhì)譜鑒定出31個蛋白，它們主要是參與光合作用、自由基清除、細胞生長和分裂、信號傳導、蛋白加工和基礎(chǔ)代謝的蛋白。
　　 4、抗寒相關(guān)基因的克隆與表達分析
　　 應(yīng)用RT-PCR和RACE方法克隆了蛋白質(zhì)組學分析中的光合放氧33 kD蛋白、鋅指蛋白、抗壞血酸過氧化物酶、景天庚酮-1，7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、泛素蛋白、磷酸核酮糖激酶、谷氨酰胺合成酶

6、、熱激蛋白、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白、14-3-3蛋白、葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶、咖啡酰輔酶A甲基轉(zhuǎn)移酶、碳酸酐酶、水通道蛋白、鈣依賴型蛋白激酶蛋白基因cDNA全長，并同源克隆了葉綠素a/b結(jié)合蛋白1、葉綠素a/b結(jié)合蛋白2、葉綠素a/b結(jié)合蛋白4和CBF基因cDNA全長。其中10個基因成功在大腸桿菌中表達，獲得相應(yīng)外源蛋白，并對熱激蛋白經(jīng)Western-blot驗證確認。利用實時熒光定量技術(shù)對獲得的基因進行了低溫脅迫下時空表達模式分析，結(jié)

7、果顯示所有的基因在低溫下均發(fā)生變化，但各基因的變化規(guī)律不同，如磷酸核酮糖激酶、泛素蛋白、Rubisco活化酶、谷氨酰胺合成酶、14-3-3蛋白、光合放氧33 kD蛋白、水通道蛋白、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、碳酸酐酶等基因在低溫脅迫前期的變化較大，可能與各基因參與低溫脅迫時的功能有關(guān)。已獲得的cDNA全長中有43.8%在mRNA水平和蛋白水平表達相一致，56.2%的基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達并沒有直接伴隨在蛋白水平的表達。
　　 5、抗寒相