四倍體載培棉種高密度遺傳圖譜的加密及棉花紅析R1和茸毛T1基因的精細(xì)定位.pdf

1、棉花是世界性重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉纖維的品質(zhì)和色彩可以大大提升其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。高密度的遺傳圖譜是植物基因組研究的基礎(chǔ)?？捎行шU明基因組的結(jié)構(gòu)特征，為重要性狀基因的精細(xì)定位和圖位克隆奠定基礎(chǔ)。棉花葉片密生茸毛和紅株性狀均由單顯性基因控制。葉片中茸毛的發(fā)育不僅與棉纖維發(fā)育有相似之處，而且多毛具有抗蟲特性。紅葉中決定色素形成的基因可有效用于培育天然彩棉的育種實(shí)踐中。精細(xì)定位這2個(gè)關(guān)鍵基因，獲得其候選相關(guān)基因，進(jìn)而進(jìn)行結(jié)構(gòu)、表達(dá)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，不僅

2、可闡明其作用機(jī)理，而且可為棉花纖維品質(zhì)改良、抗蟲育種及天然彩棉的培育提供重要基因資源。本研究在前人構(gòu)建海陸棉花種間遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)和利用棉花新標(biāo)記，進(jìn)行圖譜加密和染色體結(jié)構(gòu)特征分析;利用加密的圖譜信息，完成棉花茸毛及紅株兩個(gè)質(zhì)量性狀基因T1和R1的染色體精細(xì)定位和其候選基因的初步分析;結(jié)合已釋放的不同棉種EST及基因組序列信息，進(jìn)行棉花WRKY類家族基因的全基因發(fā)掘、鑒定、分類和表達(dá)初步分析。主要研究結(jié)果如下:
　　

3、 1、高密度海陸種間遺傳圖譜的構(gòu)建及基因組結(jié)構(gòu)分析
　　 本研究利用新開發(fā)的gSSR引物及網(wǎng)上公開釋放的部分CER、CGR、COT、DC、DPL、SHIN及HAU編號(hào)的引物，與已開發(fā)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行冗余篩選，獲得1431對(duì)非冗余引物，在作圖親本TM-1和Hai7124之間篩選多態(tài)性，進(jìn)而完成圖譜的加密工作。新獲得的海陸栽培棉種種間遺傳圖譜包含3414個(gè)位點(diǎn)，總長為3677.6cM，標(biāo)記間的平均距離為1.08cM，分布在26條

4、連鎖群上。
　　 該圖譜上包含941個(gè)重復(fù)位點(diǎn)，分別由425對(duì)引物在親本TM-1和Hai7124間擴(kuò)增產(chǎn)生。這些重復(fù)位點(diǎn)主要來源于SSR、REMAP、SRAP、AFLP、RT和In-Del等5種標(biāo)記類型。其中326對(duì)SSR引物產(chǎn)生693個(gè)重復(fù)位點(diǎn)，包括287對(duì)SSR引物產(chǎn)生2個(gè)位點(diǎn);37對(duì)產(chǎn)生3個(gè)位點(diǎn);2對(duì)產(chǎn)生4個(gè)位點(diǎn)。分析這些重復(fù)位點(diǎn)的染色體分布，除位于部分同源染色體上的重復(fù)位點(diǎn)外，一些重復(fù)位點(diǎn)位于同一染色體上，另一些重復(fù)位點(diǎn)

5、位于非同源的不同染色體上，表明在四倍體棉花進(jìn)化進(jìn)程中基因組染色體內(nèi)部及染色體間發(fā)生了復(fù)制和重排等結(jié)構(gòu)變異。
　　 新構(gòu)建的遺傳圖譜上含86個(gè)位點(diǎn)簇(≥5 loci/cM)，涉及617個(gè)位點(diǎn)。除Chr.1上未發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)簇外，這86個(gè)位點(diǎn)簇分布在其余25個(gè)連鎖群上，分布密度不均勻。其中，31個(gè)位點(diǎn)簇分布在At亞組上，涉及到229個(gè)位點(diǎn);55個(gè)位點(diǎn)簇分布于Dt亞組上，涉及到388個(gè)位點(diǎn)。同時(shí)也檢測(cè)到19個(gè)基因島(≥5 EST-SSR l

6、oci/cM)和1個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)(≥5 REMAP loci/cM)。
　　 300個(gè)位點(diǎn)在作圖群體中不符合孟德爾遺傳規(guī)律(P＜0.05)。在連鎖群上構(gòu)成12個(gè)偏分離富集區(qū)，At亞組和Dt亞組各分布6個(gè)。這12個(gè)偏分離富集區(qū)分布在11條染色體上，其中在Chr.20上有兩個(gè)偏分離富集區(qū)。在偏分離富集區(qū)上位點(diǎn)的偏向保持著一致性，其中8個(gè)偏向于親本TM-1，4個(gè)偏向于雜合子。
　　 2、兩個(gè)質(zhì)量性狀基因的精細(xì)定位和候選基因篩

7、選
　　 以構(gòu)建的高密度海陸種間遺傳圖譜為基礎(chǔ)，分別利用(Sub16×T586)F2群體和[(Hai7124×T586)×Hai7124] BC1群體，完成棉花兩個(gè)重要的質(zhì)量性狀基因—紅株R1和茸毛T1基因的精細(xì)定位。將紅株R1基因定位在第16染色體標(biāo)記NAU4956和NAU6752之間，遺傳距離分別為2.91cM和0.49cM;將茸毛T1基因定位在第6染色體NAU5434與NAU1277之間，距最近標(biāo)記 NAU5434的遺傳距

8、離為0.6cM。
　　 基于精細(xì)定位的結(jié)果和網(wǎng)上公開釋放的棉花D基因組雷蒙德氏棉種的基因組序列信息，根據(jù)目標(biāo)基因附近的標(biāo)記序列映射雷蒙德氏棉基因組序列，獲得目標(biāo)基因所在的候選物理區(qū)域。利用Fgenesh程序?qū)蜻x的物理區(qū)域進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)及BLAST2Go的功能注釋及代謝特征分析，結(jié)合所克隆基因作用特征完成候選基因的確定及功能初步分析。針對(duì)色素合成代謝途徑特點(diǎn)，篩選了6個(gè)候選基因，分別命名為RG1-RG6;參考前人擬南芥表皮毛發(fā)育

9、研究結(jié)果，初步確定標(biāo)記映射區(qū)域與棉花密生茸毛性狀相關(guān)的6個(gè)候選基因，分別命名為TG1-TG6。
　　 形態(tài)及掃描電鏡分析顯示，隨著葉齡發(fā)育，T586的葉片色素沉積越來越多。葉片茸毛的發(fā)育隨著葉齡發(fā)育逐漸變稀，但每一發(fā)育階段，T586的葉片茸毛均顯著高于Hai7124，在成熟葉片上，Hai7124僅葉脈及葉邊緣可見茸毛分布，而T586葉片密被茸毛。選擇T586和Hai7124不同葉齡的棉花葉片（葉芽、幼葉及成熟葉），進(jìn)行候選基因的

10、表達(dá)分析。Q-PCR分析表明，在控制棉花紅株性狀的6個(gè)候選基因中，基因RG4在T586色素沉積最多的成熟葉中，其表達(dá)量顯著高于同時(shí)期Hai7124葉片中的表達(dá)量，而其他候選基因在兩個(gè)親本材料色素差異最明顯時(shí)期葉片中的表達(dá)量都沒有達(dá)到顯著水平。在控制茸毛性狀的6個(gè)候選基因中，基因TG5在T586葉片每一發(fā)育階段的表達(dá)量與Hai7124之間均存在顯著或極顯著差異。同時(shí)，隨著葉片的發(fā)育，在T586和Hai7124中表達(dá)水平也隨之降低，與葉片表

11、皮茸毛密度分布特征一致。其余候選基因的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)規(guī)律性。綜合基因表達(dá)、表型變化及掃描電鏡分析結(jié)果，推測(cè)RG4和TG5是控制兩個(gè)質(zhì)量性狀紅株R1和茸毛T1的候選基因。根據(jù)BLAST2Go的功能注釋表明，RG4是一個(gè)編碼八氫番茄紅素合酶的基因;TG5為一個(gè)bHLH類型的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 3、棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組分析
　　 已有研究報(bào)道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物的生長發(fā)育、衰老等進(jìn)程，同時(shí)對(duì)各種生物脅迫和非生物

12、脅迫都有一定的響應(yīng)。在擬南芥中，AtWRKY44參與了擬南芥表皮毛形成。為了闡明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在棉花重要性狀形成中的可能角色，我們開展了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族棉花全基因組的發(fā)掘、鑒定、分類和表達(dá)初步研究。
　　 利用在NCBI上公開釋放的棉花EST序列，結(jié)合Pfam數(shù)據(jù)庫提供的WRKY轉(zhuǎn)錄因子種子文件的全部2450條種子序列，比對(duì)棉花總EST數(shù)據(jù)庫，最終得到535條WRKY類EST序列。以這535條EST序列作為探針，通過電

13、子克隆技術(shù)，獲得95個(gè)含有WRKY結(jié)構(gòu)域的Contig，其中74個(gè)Contig中至少含有一個(gè)完整的WRKY結(jié)構(gòu)域，暫命名為Contig1-Contig74。與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化分析顯示，74個(gè)Contig屬于3個(gè)組及5個(gè)亞組，其中3個(gè)組—GroupⅠ、GroupⅡ和GroupⅢ，分別含有16、49和9個(gè)Contig。GroupⅡ的五個(gè)亞組—GroupⅡ a、GroupⅡ b、GroupⅡ c、GroupⅡd和GroupⅡ

14、e分別含有5、2、25、12和5個(gè)Contig。
　　 利用公布的雷蒙德氏棉全基因組序列草圖，進(jìn)一步對(duì)雷蒙德氏棉全基因組進(jìn)行了WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的預(yù)測(cè)，共得到109個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。分子進(jìn)化分析將該轉(zhuǎn)錄因子家族成員分為3大類，其中GroupⅠ有19個(gè)成員，GroupⅡ有78個(gè)成員，GroupⅢ有12個(gè)成員。進(jìn)一步與來源于擬南芥的WRKY家族基因聚類結(jié)果分析，將GroupⅡ分成GroupⅡa、GroupⅡb、Gro

15、upⅡc、GroupⅡd和GroupⅡ e五個(gè)亞組，每個(gè)組成員分別有7個(gè)、15個(gè)、29個(gè)、15個(gè)和12個(gè)。通過序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)成員在WRKYGQK的保守結(jié)構(gòu)域上存在有WRKYGKK的變異，分別是Gr WRKY31、GrWRKY39、GrWRKY46、GrWRKY35和GrWRKY78，并且這5個(gè)成員都屬于GroupⅡ c亞組;在GroupⅡc中的GrWRKY8還存在WRKYGHK結(jié)構(gòu)域變異。除了在WRKYGQK的保守結(jié)構(gòu)域上存在變異

16、，在GroupⅠ N、GroupⅠ C和GroupⅢ中發(fā)現(xiàn)WRKY家族成員在鋅指結(jié)構(gòu)上也存有一定的變異。
　　 通過序列相似性比對(duì)來自棉花EST數(shù)據(jù)庫和雷蒙德氏棉基因組的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，前期預(yù)測(cè)的74個(gè)Contig中，除屬于GroupⅡc亞組的Contig69、70、71和73等4個(gè)Contig外，70個(gè)Contig能在二倍體D基因組雷蒙德氏棉中找到高度相似的同源序列。推測(cè)4個(gè)未找到同源序列的Contig可能是四倍體棉種在進(jìn)化

17、過程中獲得的新基因或是At亞組專有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。
　　 從陸地棉TM-1基因組中克隆獲得Gh WRKY19、GhWRKY23、GhWRKY60、GhWRKY87、GhWRKY95等5個(gè)成員全長ORF的基因組信息。其中，Gh WRKY19ORF全長為1401bp，編碼466個(gè)氨基酸，含有4個(gè)內(nèi)含子;GhWRKY23 ORF全長為942bp，編碼313個(gè)氨基酸，含有4個(gè)內(nèi)含子;GhWRKY60 ORF全長為1068bp，編碼3

18、55個(gè)氨基酸，含有2個(gè)內(nèi)含子;GhWRKY87 ORF全長為807bp，編碼268個(gè)氨基酸，含有2個(gè)內(nèi)含子;GhWRKY95 ORF全長為966bp，編碼321個(gè)氨基酸，含有2個(gè)內(nèi)含子。不同組織、器官表達(dá)特征表明，WRKY類基因在根莖葉等營養(yǎng)器官中的表達(dá)量普遍高于在棉纖維中的表達(dá)量。GhWRKY38在根中高表達(dá);GhWRKY19、GhWRKY87和Gh WRKY43在葉中高表達(dá);GhWRKY74在根和莖中高表達(dá);而GhWRKY21和Gh

19、WRKY60在根和葉中高表達(dá)。在纖維發(fā)育進(jìn)程中高表達(dá)的WRKY家族成員主要檢測(cè)到Gh WRKY19、Gh WRKY21和GhWRKY23，其高表達(dá)的時(shí)期集中在-3dpa-5dpa，沒有檢測(cè)到在纖維發(fā)育后期高表達(dá)的基因。
　　 以陸地棉抗逆品種晉棉19三葉期幼苗為試驗(yàn)材料，進(jìn)行水楊酸(2mM SA)、茉莉酸甲酯(100tM MeJA)、脫落酸(200μMABA)、赤霉素(500μM GA)、鹽(200mM NaCl)、干旱(20％