一種綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的基因克隆、表達及其特性分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文以金龜子綠僵菌蝗變種(Metarhizium anisopliae var.acridum)CQMa102菌株的總RNA為模板,以RT、1P5和1P3、2P5和2P3為引物,在體外通過RT-PCR的方式成功克隆出了該菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表達基因序列。將該基因片段克隆到表達載體pPIC9K中,轉化畢赤酵母KM71,并用0.5%的甲醇對其進行誘導培養(yǎng)。對誘導培養(yǎng)144h后的粗酶液進行SDS-PAGE和酶特性分析,結果表明重組PD在畢赤酵

2、母中表達出了酪氨酸蛋白磷酸酶。有研究已經(jīng)表明,該酶在體外能改變其寄主(蝗蟲)血淋巴中與信號傳導相關的蛋白(Toll-likereceptor)的磷酸化狀態(tài),進而可能干涉寄主體內免疫活動。因此,本研究將為從蛋白水平分析綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶對蝗蟲體液免疫防御的影響和探討病原真菌干擾寄主體液免疫的可能機制提供物質基礎。
   全文的主要結論如下:
   一、綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆
   根據(jù)綠僵菌酪氨酸蛋白

3、磷酸酶基因的已知序列設計引物,從綠僵菌的總RNA中擴增出一條1900bp左右的基因片段。將該基因片段和pMD19-T質粒連接,轉化感受態(tài)大腸桿菌,結合PCR方法篩選陽性克隆。其基因片段的序列分析結果表明該基因片段共1960bp,含有引物中的2個EcoRI酶切位點和6個組氨酸標記;而且該基因片段中含有綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的表達基因,可編碼一個含647個氨基酸的蛋白質,該蛋白質氨基酸序列中還包含酪氨酸蛋白磷酸酶質譜測序獲得的有5段肽段氨基

4、酸序列即:DITNFFGVKEPEVEK,WYEDLFAEDK,GNDSALDLPGLK,NIQYGTGVNFPSNWEPR,ALGDLLEELDDTVR;證明克隆正確。
   二、畢赤酵母的表達重組載體的構建
   根據(jù)畢赤酵母表達系統(tǒng)的特點和要求,選用pPIC9K質粒載體連接目的基因,轉化感受態(tài)大腸桿菌,結合PCR方法篩選陽性克隆。陽性克隆的測序分析結果表明目的基因已經(jīng)插入pPIC9K質粒的開放閱讀框內,且目的基因的

5、5’端連接在pPIC9K質粒的信號端,證明目的基因的畢赤酵母表達重組載體已經(jīng)構建成功。
   三、目的基因的整合及其高效表達菌株的篩選
   用電轉化法將構建的畢赤酵母重組載體轉化感受態(tài)畢赤酵母KM71,并結合遺傳霉素抗性和PCR方法篩選陽性克隆。挑取不同遺傳霉素抗性的陽性克隆進行甲醇誘導表達,對不同時間段的培養(yǎng)液進行透析、ρNPP底物的相對酶活性測定。其培養(yǎng)液相對酶活性測定的分析結果表明,抗遺傳霉素濃度為3.0mg/m

6、l的14號菌株的培養(yǎng)液相對酶活性明顯高于其他菌株,且該菌株培養(yǎng)144h時的培養(yǎng)液相對酶活性最高,證明14號菌株有可能高效表達目的蛋白。
   四、粗酶液的SDS-PAGE及其酶特性分析
   粗酶液經(jīng)過SDS-PAGE分析得到一條75.6KDa的蛋白質片段,與目的基因表達的酪氨酸蛋白磷酸酶的分子量大致相同。酶底物特異性分析表明粗酶液中的磷酸酶對磷酸酪氨酸殘基的專一性較強,Cu2+可明顯抑制該粗酶液對8mM PNPP的水解

7、作用,Ca2+可促進該粗酶液對8mM pNPP的水解作用,而Mg2+、Ni2+、Mn2+對該粗酶液水解8mM PNPP的活性影響不明顯;而且絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶專性抑制劑NaF、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶抑制劑EDTA對磷酸酶酶解pNPP活性沒有明顯的抑制作用,酸性磷酸酶的特異性抑制劑酒石酸鈉也對該粗酶液酶解ρNPP活性影響不明顯;但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑鉬酸鈉和鎢酸鈉顯著抑制酶對ρNPP的酶解活性,證明目的基因表達的蛋白質是酪氨酸蛋白

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