蛋白磷酸酶-1cβ在金魚胚胎發(fā)育中的功能研究.pdf

1、許多細(xì)胞在行使生物學(xué)功能的過程中，蛋白質(zhì)的可逆磷酸化屬于至關(guān)重要的調(diào)節(jié)機制，蛋白激酶與蛋白磷酸酶分別執(zhí)行磷酸化和去磷酸化功能，PP1是主要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一。在本論文中，我們將把重心放在研究PP1的催化亞基C的異構(gòu)體β(Beta)基因(PP-1cβ)。首先，我們采用RACE克隆技術(shù)克隆出金魚β基因的cDNA全長，然后，利用RT-PCR技術(shù)分析研究β基因在金魚不同胚胎時期和不同組織的mRNA水平的表達(dá)，最后，我們用Morpholi

2、no Oligomers(MO)沉默或構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒載體，研究分析PP-1cβ在金魚胚胎發(fā)育的功能。其結(jié)果如下:
　　 (1)金魚中PP-1cβ的cDNA全長1344bp，其中編碼區(qū)984bp，編碼一個含327個氨基酸的蛋白質(zhì)，預(yù)測的分子量約為37.1 kDa。比較氨基酸序列同源性分析表明:該蛋白序列與斑馬魚的同源相似度為96.6％，與小鼠的為97.5％，與非洲爪蟾的為97.8％，與人的為97.5％。其同源性分析表明了β調(diào)節(jié)亞基

3、的氨基酸序列在不同物種間具備較高同源性，暗示了該基因在功能和進(jìn)化上具備較高保守性，同時說明PP1-cβ基因在功能上的至關(guān)重要性，但其在氨基和羧基末端存在的差異性，則暗示PP1-cβ基因具備了多種不同的重要功能。
　　 (2)經(jīng)過RT-PCR的分析，證明了在不同組織中的mRNA表達(dá)水平上，該基因在大腦中表達(dá)為最高，精巢次之，在卵巢、腎、肌肉、心臟、肝五種組織中的表達(dá)水平相對較高，鰭、鰓中的表達(dá)相對較低。在不同胚胎時期，神經(jīng)胚時期表

4、達(dá)最強，在肌肉效應(yīng)期中的表達(dá)次之，二細(xì)胞時期、多細(xì)胞時期、囊胚時期、眼色素時期、表達(dá)較高，原腸胚時期、視原基時期、腦泡時期、心跳時期、出膜時期表達(dá)較低，體色素時期達(dá)最低。因此我們推測PP-1cβ基因在金魚不同組織和胚胎發(fā)育的不同時期中可能起到了多種重要的作用。
　　 (3)另外，我們應(yīng)用顯微注射技術(shù)，我們將成功構(gòu)建的PP-1cβ基因過表達(dá)載體以及PP-1cβ的Morpholino Oligomers注入到金魚胚胎里，用來觀察金魚

5、胚胎發(fā)育異常。我們觀察到注射成功的金魚胚胎產(chǎn)生了嚴(yán)重的畸形，如胚胎眼睛由于改變其分化模式，從而導(dǎo)致眼睛大小異常，而且由于不均等的細(xì)胞分裂與分化，導(dǎo)致金魚胚胎脊柱彎曲，這更加說明了PP-1cβ對胚胎發(fā)育起到了十分重要的作用。接著，利用石蠟切片技術(shù)觀察了注射成功的金魚胚胎組織的一系列變化，發(fā)現(xiàn)眼睛晶狀體和視網(wǎng)膜等主要部位發(fā)育畸形，大腦發(fā)育畸形等。這樣我們可以深入研究該基因?qū)痿~發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。
　　 總之，以上結(jié)果為我們在較低等的脊