支鏈氨基酸合成途徑相關(guān)基因在稻瘟病菌生長發(fā)育及致病過程中的功能研究.pdf

1、稻瘟病是水稻上的三大病害之一，給世界的糧食安全帶來了嚴重威脅。由于該病原菌生理小種易變，因此稻瘟病的防治始終是目前水稻生產(chǎn)上的一個重要難題。稻瘟病菌作為一種模式病原茵，研究其在侵染過程各階段重要基因的功能及致病分子機制有助于制定長期有效的稻瘟病菌防治策略。隨著稻瘟病菌全基因組測序的完成，運用分子生物學手段鑒定致病相關(guān)基因已經(jīng)越來越方便。其中蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)是近幾年來在各個生命科學領域廣泛應用的一種檢測差異蛋白的方法。稻瘟病菌G蛋白在信

2、號轉(zhuǎn)導過程中起著非常重要的作用，參與調(diào)控稻瘟病菌的生長發(fā)育、孢子的產(chǎn)生、附著胞的形成和致病性過程。G蛋白信號途徑的調(diào)控因子RGS(RegulatorsofG-proteinssignaling)是G蛋白信號途徑的負調(diào)控因子。在稻瘟病菌全基因組中共鑒定到8個MoRGS基因，對這些基因進行生物學功能分析發(fā)現(xiàn)，MoRGS1作為Gα的負調(diào)控因子參與調(diào)控稻瘟病菌的無性繁殖、附著胞的分化、細胞壁的完整性以及致病過程;MoRGS2主要參與無性繁殖;M

3、oRGS3和MoRGS4作為Gα的負調(diào)控因子參與調(diào)控有性/無性、產(chǎn)孢及致病性;MoRGS7主要參與調(diào)控稻瘟病菌的致病性;缺失MoRGS5、MoRGS6和MoRGS8對致病性沒有影響。為了進一步闡明稻瘟病菌中MoRgs蛋白(MoRgs1、MoRgs2、MoRgs3、MoRgs4、MoRgs7)的調(diào)控機制，運用蛋白質(zhì)組學的方法分析獲得⊿Morgs突變體與野生型顯著差異表達蛋白，并對感興趣的相關(guān)蛋白作進一步的研究。本論文主要對支鏈氨基酸合成途

4、徑中的乙酰乳酸合成酶(ALS)和蘇氨酸脫氨酶(TD)在稻瘟茵生長發(fā)育及致病過程中的功能進行了系統(tǒng)的研究。
　　雙向電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果共鑒定到76個顯著差異表達蛋白，這些蛋白參與到各種生理生化過程，包括氨基酸代謝、糖代謝、信號轉(zhuǎn)導、遺傳信息過程等方面。分析發(fā)現(xiàn)在⊿Morgs突變體中有9個與氨基酸合成相關(guān)的基因，其中MoILV6基因在⊿Morgs7突變體中極顯著下調(diào)表達，該基因參與支鏈氨基酸亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸

5、(Val)的生物合成。通過在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫進行BlastP分析，發(fā)現(xiàn)一個與酵母ILV2同源的基因MoILV2，其與基因MoILV6共同編碼乙酰乳酸合成酶。
　　乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，催化生成亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。研究發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌中⊿Moilv2和⊿Moilv6突變體表現(xiàn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸生長缺陷，產(chǎn)孢能力、附著胞侵入能力及致病性喪失。但是外源添加高濃度的三種氨基酸能恢復突變體的產(chǎn)孢缺陷及致病

6、力。進一步亞細胞定位觀察，MoIlv2和MoIlv6均定位線粒體行使功能，且MoIlv6的信號肽對其定位是非常關(guān)鍵的。
　　蘇氨酸脫氨酶是該支鏈氨基酸合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶，該酶催化蘇氨酸脫水分解生成氨和α-酮丁酸，是合成支鏈氨基酸異亮氨酸的關(guān)鍵蛋白。本文從稻瘟病菌中克隆了一個與酵母Ilv1p同源的基因MoILV1，通過同源重組的方法獲得目的基因敲除突變體⊿Moilv1。對稻瘟病菌中MoILV1進行功能分析，結(jié)果表明該基因缺失突