支鏈氨基酸合成途徑相關(guān)基因在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的功能研究.pdf

1、稻瘟病是水稻上的三大病害之一，給世界的糧食安全帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。由于該病原菌生理小種易變，因此稻瘟病的防治始終是目前水稻生產(chǎn)上的一個(gè)重要難題。稻瘟病菌作為一種模式病原茵，研究其在侵染過(guò)程各階段重要基因的功能及致病分子機(jī)制有助于制定長(zhǎng)期有效的稻瘟病菌防治策略。隨著稻瘟病菌全基因組測(cè)序的完成，運(yùn)用分子生物學(xué)手段鑒定致病相關(guān)基因已經(jīng)越來(lái)越方便。其中蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)是近幾年來(lái)在各個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種檢測(cè)差異蛋白的方法。稻瘟病菌G蛋白在信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著非常重要的作用，參與調(diào)控稻瘟病菌的生長(zhǎng)發(fā)育、孢子的產(chǎn)生、附著胞的形成和致病性過(guò)程。G蛋白信號(hào)途徑的調(diào)控因子RGS(RegulatorsofG-proteinssignaling)是G蛋白信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子。在稻瘟病菌全基因組中共鑒定到8個(gè)MoRGS基因，對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，MoRGS1作為Gα的負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控稻瘟病菌的無(wú)性繁殖、附著胞的分化、細(xì)胞壁的完整性以及致病過(guò)程;MoRGS2主要參與無(wú)性繁殖;M

3、oRGS3和MoRGS4作為Gα的負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控有性/無(wú)性、產(chǎn)孢及致病性;MoRGS7主要參與調(diào)控稻瘟病菌的致病性;缺失MoRGS5、MoRGS6和MoRGS8對(duì)致病性沒有影響。為了進(jìn)一步闡明稻瘟病菌中MoRgs蛋白(MoRgs1、MoRgs2、MoRgs3、MoRgs4、MoRgs7)的調(diào)控機(jī)制，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析獲得⊿Morgs突變體與野生型顯著差異表達(dá)蛋白，并對(duì)感興趣的相關(guān)蛋白作進(jìn)一步的研究。本論文主要對(duì)支鏈氨基酸合成途

4、徑中的乙酰乳酸合成酶(ALS)和蘇氨酸脫氨酶(TD)在稻瘟茵生長(zhǎng)發(fā)育及致病過(guò)程中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。
　　雙向電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果共鑒定到76個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，這些蛋白參與到各種生理生化過(guò)程，包括氨基酸代謝、糖代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳信息過(guò)程等方面。分析發(fā)現(xiàn)在⊿Morgs突變體中有9個(gè)與氨基酸合成相關(guān)的基因，其中MoILV6基因在⊿Morgs7突變體中極顯著下調(diào)表達(dá)，該基因參與支鏈氨基酸亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸

5、(Val)的生物合成。通過(guò)在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastP分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與酵母ILV2同源的基因MoILV2，其與基因MoILV6共同編碼乙酰乳酸合成酶。
　　乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化生成亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。研究發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌中⊿Moilv2和⊿Moilv6突變體表現(xiàn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸生長(zhǎng)缺陷，產(chǎn)孢能力、附著胞侵入能力及致病性喪失。但是外源添加高濃度的三種氨基酸能恢復(fù)突變體的產(chǎn)孢缺陷及致病

6、力。進(jìn)一步亞細(xì)胞定位觀察，MoIlv2和MoIlv6均定位線粒體行使功能，且MoIlv6的信號(hào)肽對(duì)其定位是非常關(guān)鍵的。
　　蘇氨酸脫氨酶是該支鏈氨基酸合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶催化蘇氨酸脫水分解生成氨和α-酮丁酸，是合成支鏈氨基酸異亮氨酸的關(guān)鍵蛋白。本文從稻瘟病菌中克隆了一個(gè)與酵母Ilv1p同源的基因MoILV1，通過(guò)同源重組的方法獲得目的基因敲除突變體⊿Moilv1。對(duì)稻瘟病菌中MoILV1進(jìn)行功能分析，結(jié)果表明該基因缺失突