稻瘟病菌G蛋白及MAPK信號(hào)途徑相關(guān)基因的功能分析.pdf

1、稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)上的一種毀滅性真菌病害。該病害嚴(yán)重限制和威脅全球的水稻生產(chǎn)。生產(chǎn)上人們廣泛地選育抗病品種防治此病，但由于該病原菌的致病性易變，新的致病小種的產(chǎn)生容易導(dǎo)致新選育的抗病品種失去利用價(jià)值。因此，稻瘟病的防治始終是水稻生產(chǎn)上的一個(gè)重要難題，而控制該病原菌的一個(gè)重要前提是了解其生長發(fā)育及其致病過程的分子機(jī)制。近年來，稻瘟病菌全基因組序列的公布和遺傳轉(zhuǎn)化體系的完善加速了稻瘟病菌致病相關(guān)基因的發(fā)掘和鑒定，同時(shí)也為從基

2、因組水平上理解稻瘟病菌致病分子機(jī)制提供了新的平臺(tái)。本論文主要對(duì)G蛋白信號(hào)途徑及MAPK激酶途徑相關(guān)基因在稻瘟菌生長發(fā)育及致病過程中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，研究結(jié)果如下：
　　 G蛋白調(diào)控因子(regulators of G-protein signaling，RGS)是G蛋白信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子。在稻瘟病菌全基因序列中鑒定到4個(gè)分別與Saccharomyces cerevisiae Sst2、Rgs2、Rax1及Mdm1同源的基

3、因MoRGS1、MoRGS2、MoRGS3及MoRGS4。同時(shí)通
　　 過關(guān)鍵詞搜索鑒定到另外4個(gè)RGS編碼基因MoRGS5、MoRGS6、MoRGS7和MoRGS8。這8個(gè)RGS基因均含有保守的RGS功能域，MoRGS3、MoRGS4、MoRGS6、MoRGS7和MoRGS8含有跨膜結(jié)構(gòu)域。對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，缺失MoRGS5、MoRGS6和MoRGS8對(duì)該病菌沒有明顯影響；MoRGS2參與無性繁殖；MoRGS3

4、和MoRGS4分別作為Gα的負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控有性/無性產(chǎn)孢及致病性；MoRGS4還參與調(diào)控胞外漆酶和過氧化物酶活性；而MoRGS7主要參與調(diào)控致病過程；△Morgs1突變體表型與已報(bào)道的結(jié)果非常相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MoRGS1還參與細(xì)胞壁完整性及通過負(fù)調(diào)控Gα亞基MAGB參與有性生殖；通過反饋調(diào)控致病因子Mpg1的表達(dá)從而參與該病菌的菌絲疏水性及致病性。進(jìn)一步研究的結(jié)果表明，8個(gè)RGS蛋白均參與調(diào)控胞內(nèi)cAMP水平和PTH11的表達(dá)。表達(dá)

5、和定位分析發(fā)現(xiàn)，MoRgs1-8主要定位于細(xì)胞膜上。
　　 G蛋白通過感受外界信號(hào)從而激活cAMP信號(hào)途徑；而胞內(nèi)的cAMP主要由稻瘟病菌致病因子腺苷酸環(huán)化酶Mac1催化合成。本研究鑒定到S.cerevisiae Srv2的同源蛋白MoCapl(cyclsae-associated protein)。MoCap1與Mac1相互作用，且具有類似Srv2的典型保守結(jié)構(gòu)域。敲除MoCAP1基因?qū)е碌疚敛【鸂I養(yǎng)生長減慢、產(chǎn)孢量減少。△M

6、ocap1突變體的分生孢子在疏水界面上都能形成正常的附著胞，但芽管異常。突變體的致病性顯著下降，侵染菌絲擴(kuò)展出現(xiàn)缺陷。胞內(nèi)cAMP濃度和MAC1的轉(zhuǎn)錄水平均顯著降低，外源的cAMP可部分抑制突變體的芽管生長及分枝。表明MoCap1作為一個(gè)重要的致病因子參與調(diào)控稻瘟病菌的營養(yǎng)生長、芽管生長及附著胞分化。
　　 磷酸二酯酶PDEase(phosphodiesterase)的主要作用是水解cAMP，與Mac1共同調(diào)控胞內(nèi)cAMP的平衡

7、。在稻瘟病菌全基因序列中鑒定到2個(gè)分別與S.cerevisiae磷酸二酯酶Pde1和Pde2同源的蛋白MoPdeL和MoPdeH。這2個(gè)蛋白均具有磷酸二酯酶保守的特征序列，且MoPdeH在分生孢子和侵染階段高度表達(dá)。對(duì)MoPDEL和MoPDEH敲除突變發(fā)現(xiàn)，MoPDEL主要參與該病菌的無性繁殖和孢子的形態(tài)建成，同時(shí)對(duì)胞內(nèi)cAMP濃度具有一定的調(diào)控作用；而MoPDEH通過調(diào)控胞內(nèi)的cAMP濃度從而控制分生孢子形態(tài)、細(xì)胞壁完整性、菌絲疏水性

8、及其致病過程。在△magB和△pka1突變中分別缺失MoPDEH基因后，可部分互補(bǔ)這兩個(gè)突變體的表型缺陷。在△MopdeH突變體中過表達(dá)MPG1，發(fā)現(xiàn)MoPDEH可通過一個(gè)反饋機(jī)制調(diào)控致病因子MPG1的表達(dá)，從而控制菌絲的疏水性及病菌的致病性。進(jìn)一步對(duì)突變體進(jìn)行芯片分析，并從芯片數(shù)據(jù)中選取9個(gè)基因進(jìn)行敲除突變分析，鑒定到一些潛在的致病因子。
　　 MAPK激酶途徑與G蛋白及cAMP信號(hào)途徑存在一定的聯(lián)系。本研究分別以PMK1 M

9、APK途徑的致病因子Pmdk1和Mst50為誘餌，對(duì)稻瘟病菌的2個(gè)酵母雙雜交文庫進(jìn)行篩選，鑒定到一系列與其互作的基因。選取與Pmk1互作的Pic1和Pic5及與Mst50互作的Mic5和Mic8進(jìn)行功能分析。發(fā)現(xiàn)缺失PIC1對(duì)稻瘟病菌的營養(yǎng)生長和致病性沒有明顯影響，但突變體的產(chǎn)孢量顯著下降、分生孢子在洋蔥表皮上形成具有分支的芽管，且在1根芽管上產(chǎn)生多個(gè)附著胞。缺失PIC5導(dǎo)致該病菌的營養(yǎng)生長減慢、氣生菌絲減少，在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后

10、出現(xiàn)菌絲自溶現(xiàn)象，突變體的產(chǎn)孢量和致病性都顯著下降，分生孢子在誘導(dǎo)界面上形成畸形的附著胞。缺失MIC5對(duì)稻瘟病菌的營養(yǎng)生長，產(chǎn)孢、附著胞形成及致病性均沒有明顯影響。缺失MIC8導(dǎo)致該病菌營養(yǎng)生長減慢、對(duì)外界脅迫的耐受性增強(qiáng)、產(chǎn)孢量和致病性明顯下降。GFP定位分析和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，Mic8主要定位于液泡中，且在分生孢子和侵染階段表達(dá)量相對(duì)較高。
　　 綜上所述，G蛋白信號(hào)途徑及其下游的cAMP途徑通過調(diào)控胞內(nèi)cAMP的濃度