核盤菌SsNR基因調(diào)節(jié)其生長發(fā)育及致病過程的功能研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，是典型的死體營養(yǎng)型同宗配合的子囊真菌。宿主范圍十分廣泛，能夠在油菜、大豆、向日葵等多種油料經(jīng)濟作物上引起植物的菌核病，造成巨大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失。隨著核盤菌全基因組測序完成及DNA測序、RNA干擾(RNA interference，RNAi)、高通量蛋白質(zhì)組學和代謝組學等技術的快速發(fā)展，為全球植物病理學家開展核

2、盤菌功能基因的研究提供了便利。
　　硝酸鹽是高等植物、藻類、真菌、酵母和細菌等生物氮攝入的主要營養(yǎng)物質(zhì)。硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)是氮素同化過程中關鍵的酶，其在細菌、真菌和高等植物的多種器官和組織中均有分布，該酶的活力影響了硝酸鹽同化成有機化合物的快慢。因此，硝酸還原酶是決定生物氮素代謝過程中的關鍵酶之一，與生物吸收利用氮素有密不可分的關系。有研究表明，粗糙脈孢菌NR突變體利用硝酸鹽的能力下降，光照可促

3、進其產(chǎn)孢。但在核盤菌中至今沒有NR基因的任何研究。本研究希望通過對核盤菌NR的研究完善理論基礎、填補空白及通過對該基因功能的研究，了解其致病機理。
　　本研究克隆出核盤菌硝酸還原酶編碼基因序列SsNR，采用基因沉默構建了SsNR-pSilent-1表達載體，利用PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術獲得NR基因沉默突變體菌株。通過HygB抗性、表型生長和RT-PCR篩選出突變菌株NR12和NR66兩株沉默抑制率較好的菌株。對SsNR在核盤菌

4、生長、發(fā)育及致病過程中的作用進行了研究，主要結果如下:
　　(1)與野生型相比，SsNR突變體菌落生長速度變慢、菌絲末端分支短而多、菌核發(fā)育形成受阻，侵染墊畸形，產(chǎn)草酸能力減弱。
　　(2)在Congo Red、SDS、H2O2、Sorbitol和NaCl逆境因子作用下，與野生菌株相比，突變體對Congo Red、SDS、H2O2和NaCl高度敏感，菌落直徑抑制明顯，而僅對Sorbitol逆境脅迫不敏感。
　　(3)油

5、菜與大豆離體葉片接種試驗顯示野生菌株病斑面積占整個葉片面積分別為12.43％～13.66％和55.72％～57.21％，而兩個沉默突變體菌株病斑率分別為3.28％～4.73％和14.39％～15.72％，突變體致病力明顯下降。
　　(4)致病性相關基因的表達量分析表明沉默突變體Ggt1、Sac1和Smk3基因表達下調(diào)，而Ubq和CYP基因表達上調(diào)。
　　上述結果表明SsNR在核盤菌的營養(yǎng)生長、菌核發(fā)育形成、附著胞侵染墊的形成