無乳鏈球菌魚源株的免疫原性蛋白篩選和比較基因組學(xué)分析.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）是革蘭陽性，β溶血的鏈狀球菌。因其蘭氏分群為B群，人醫(yī)臨床常以B群鏈球菌相稱(groupBstreptococci，GBS)。該菌的感染譜較廣，不僅可引起人類新生兒敗血癥和腦膜炎，也是牛乳腺炎的主要病原之一。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)該菌還可感染魚類并導(dǎo)致其發(fā)病死亡。2009年以來，我國南方羅非魚主養(yǎng)殖區(qū)每年夏季均暴發(fā)無乳鏈球菌病，死亡率高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如何防控我國的羅非魚無乳鏈球菌病

2、?不同宿主來源的無乳鏈球菌之間存在何種關(guān)系?能否將無乳鏈球菌視為一種人、哺乳動(dòng)物和魚類的共患病病原?均為研究的熱點(diǎn)問題。對(duì)我國無乳鏈球菌魚源株進(jìn)行免疫原性蛋白的篩選和基因組學(xué)分析，具有重要的理論意義及應(yīng)用前景。
　　1.無乳鏈球茸魚源株的分離與毒力分析
　　在分離、鑒定病原菌的基礎(chǔ)上進(jìn)行特性分析。2010年夏季，從廣東5個(gè)羅非魚養(yǎng)殖場中分離到20株具有β溶血、革蘭陽性的鏈狀球菌。經(jīng)PCR檢測和16SrDNA測序比對(duì)，確定均為

3、無乳鏈球菌，且血清型和MLST分型均為Ia，ST-7型。以斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測定細(xì)菌毒力，分離株的LD50分布在102至104cfu之間，以分離株GD201008-001的毒力最強(qiáng)，LD50為2.3×102cfu，該菌株將作為后續(xù)研究的代表菌株。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)魚源分離株GD201008-001對(duì)ICR小鼠的致病力極強(qiáng)，1×101cfu攻毒劑量腹腔注射可引起小鼠腦炎并導(dǎo)致80％的接種動(dòng)物在24小時(shí)內(nèi)死亡，說明小鼠對(duì)該菌株極其敏感。提示無乳鏈

4、球菌魚源株存在感染人和哺乳動(dòng)物的可能性。
　　2.無乳鏈球菌魚源株免疫原性蛋白的篩選
　　免疫蛋白質(zhì)組學(xué)能快速、準(zhǔn)確、高效地鑒定免疫反應(yīng)性蛋白抗原，是篩選亞單位疫苗候選的首選方法之一。采用免疫蛋白組學(xué)方法，以分離株GD201008-001兔高免血清、豚鼠康復(fù)血清和羅非魚抗血清作為一抗，分別與轉(zhuǎn)印在PVDF膜上的魚源株GD201008-001全茵蛋白作用，篩選無乳鏈球菌在不同狀態(tài)，不同宿主環(huán)境下的免疫反應(yīng)性抗原。共鑒定18個(gè)蛋

5、白，其中已報(bào)道的無乳鏈球菌免疫保護(hù)性蛋白有:磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，菌毛骨架蛋白(BP-2b)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)。此外，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新的免疫反應(yīng)性的蛋白。選擇免疫反應(yīng)性強(qiáng)的8個(gè)候選蛋白進(jìn)行原核表達(dá)及免疫轉(zhuǎn)印，發(fā)現(xiàn)其中的3個(gè)蛋白:支鏈a酮酸脫氫酶E2亞單位（branched-chainalpha-ketoaciddehydrogenasesubunitE2），5'核苷酸酶家族蛋白（5'-

6、nucleotidasefamilyprotein）以及氨甲?；D(zhuǎn)移酶（ornithinecarbamoyltransferase）均可被兔高免血清、豚鼠康復(fù)血清和羅非魚抗血清識(shí)別，表明這些蛋白在無乳鏈球菌魚源株感染哺乳動(dòng)物和魚類的過程中，均與機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，可作為候選的免疫保護(hù)性抗原。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)無乳鏈球菌魚源株亞單位疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。
　　3.鏈球菌表面蛋白篩選新方法的建立及在無乳鏈球菌中的

7、應(yīng)用
　　細(xì)菌的表面蛋白直接與宿主的免疫系統(tǒng)接觸，往往是致病機(jī)理中重要的抗原或毒力因子，也是亞單位疫苗的候選物。借鑒免疫學(xué)中經(jīng)典的交叉吸附方法，用高免血清與對(duì)應(yīng)細(xì)菌進(jìn)行混合吸附，獲得吸附血清。將吸附血清和未吸附的高免血清分別用于免疫蛋白組學(xué)試驗(yàn)，比較兩者免疫轉(zhuǎn)印結(jié)果的差異，建立了一種篩選細(xì)菌表面蛋白的新方法:預(yù)吸附免疫蛋白組學(xué)方法(pre-absorbedimmunoproteomicsmethod，PAIM)。用此方法篩選到無乳

8、鏈球菌魚源株GD201008-001的一個(gè)表面蛋白，命名為XF。將該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和免疫轉(zhuǎn)印，發(fā)現(xiàn)其免疫反應(yīng)性強(qiáng)，可被豚鼠康復(fù)血清和羅非魚抗血清識(shí)別。說明預(yù)吸附免疫蛋白組學(xué)方法是一種行之有效的篩選細(xì)菌表面蛋白的方法，經(jīng)其篩選到的表面蛋白XF是一種潛在的免疫保護(hù)性抗原，可作為亞單位疫苗的候選分子。
　　4.無乳鏈球菌魚源株GD201008-001的xf基因缺失株構(gòu)建及特性分析
　　為進(jìn)一步研究PAIM試驗(yàn)篩選到的無乳鏈球菌魚

9、源株GD201008-001表面蛋白XF的功能，利用鏈球菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSET4S和pSET2，通過同源重組的方法構(gòu)建了xf基因的缺失株△XF與互補(bǔ)株C△XF。生物特性分析表明，xf基因的缺失株與互補(bǔ)株的遺傳穩(wěn)定性較好，在細(xì)菌染色形態(tài)上與野生株無差異，生長速度略慢于野生株。三者對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附均不明顯，且缺失株與野生株相比無明顯差異。但是缺失株△XF對(duì)斑馬魚的毒力有明顯下降，LD50上升4倍。說明XF蛋白參與了魚源株GD20

10、1008-001對(duì)斑馬魚的致病過程，是一種與毒力相關(guān)的蛋白。
　　5.無乳鏈球茵魚源株GD201008-001全基因組測序及比較基因組學(xué)分析
　　借助成熟的Roche454和IlluminaSolexa測序技術(shù)，通過序列拼接和補(bǔ)洞，完成了魚源分離株GD201008-001的全基因組測序，在NCBI的基因組登錄號(hào)為NC_018646。GD201008-001基因組大小2.1Mb，編碼1964個(gè)蛋白，擁有7個(gè)rRNA和77個(gè)tR

11、NA，它的基本特征和CRISPR、前噬菌體、毒力基因的分布，與另一株中國魚源株ZQ0910以及人源株A909基因組最為相似。對(duì)不同宿主來源的15株無乳鏈球菌的基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn):在15株無乳鏈球菌中均保守存在的基因，即核心基因?yàn)?202個(gè)，有2040個(gè)基因是各菌株特有的基因，擬合曲線顯示無乳鏈球菌泛基因組為開放型，說明在該細(xì)菌種內(nèi)即便有數(shù)以千計(jì)的基因組被測序，還是會(huì)有新的基因出現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，中國魚源分離株GD20100

12、8-001、ZQ0910基因組與人源株A909屬于同一分支，進(jìn)化關(guān)系最近，提示可能來源同一祖先。研究還發(fā)現(xiàn)，有一段10kb的特有基因序列只存在于中國魚源株GD201008-001和ZQ0910的基因組中，含有12個(gè)ORF。這段特有序列與咽峽炎鏈球菌（S.anginosus）SK52=DSM20563菌株的基因組序列最為相似。其中一個(gè)ORF(A964_1958)注釋為LPXTG膜錨定蛋白。將A964_1958進(jìn)行原核表達(dá)和免疫轉(zhuǎn)印，發(fā)現(xiàn)它