化膿性鏈球菌表面蛋白Fba的免疫原性研究.pdf

1、目的： A族鏈球菌(GAS)是一類分布廣泛的致病菌，能引起多種臨床疾病，包括從喉或皮膚的淺表感染到高度侵襲及具有潛在致死的感染，甚至感染后嚴(yán)重的超敏反應(yīng)腎小球腎炎、風(fēng)濕性心臟病等。這些疾病都是由鏈球菌對(duì)呼吸道及皮膚的上皮細(xì)胞的黏附引起的。GAS可以通過其菌體表面蛋白與人血漿纖連蛋白(Fibronectin)結(jié)合，并以此為分子橋梁再與上皮細(xì)胞上的相關(guān)受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞，從而逃避宿主細(xì)胞對(duì)它的吞噬和殺傷<'[1]>。

2、 Fba蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的表達(dá)于GAS表面的蛋白，它至少存在于18個(gè)血清型中，并具有結(jié)合FHL-1、FH和纖連蛋白的能力。研究表明，F(xiàn)ba蛋白有助于GAS的抗吞噬，與FHL-1結(jié)合后能促進(jìn)GAS進(jìn)入人體上皮細(xì)胞，是一種重要的毒力因子<'[2，3]>。鑒于此，本課題選取了Fba蛋白編碼基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建了Fba原核表達(dá)質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒，之后誘導(dǎo)原核質(zhì)粒表達(dá)，通過Western blot和ELISA檢測(cè)重組蛋白。并將真核表達(dá)質(zhì)粒和純化的

3、重組Fba蛋白免疫小鼠，對(duì)它們所誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫進(jìn)行評(píng)估，以進(jìn)一步對(duì)其免疫原性及Fba在抗GAS感染免疫中的作用進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研制以其為基礎(chǔ)的診斷試劑和疫苗提供依據(jù)。 方法： 1 PCR方法擴(kuò)增Fba基因，克隆至pMD18-T載體上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確后，經(jīng)BamHI、EcoRI和BamHI、XhoI雙酶切后，將其分別克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1。 2 原核表達(dá)質(zhì)

4、粒通過IPTG誘導(dǎo)，獲得了高效表達(dá)的蛋白包涵體，采用從SDS凝膠上電洗脫回收的方法進(jìn)行純化回收，Western-blot和ELISA鑒定表達(dá)的目的蛋白。 3 以該蛋白作為抗原包被酶聯(lián)板檢測(cè)GAS全菌免疫鼠血清，未免疫鼠血清，抗鏈"O"陽性病人血清及健康志愿者血清中可能存在的Fba抗體，同時(shí)以GAS的M蛋白包板檢測(cè)以上各類血清中的M抗體作為陽性對(duì)照。 4 雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成6組，分別為Fba蛋白免疫組、M蛋白免疫

5、組、pcDNA3.1/fba+Fba.蛋白免疫組、pcDNA3.1/fba免疫組、pcDNA3.1空質(zhì)粒對(duì)照組及PBS對(duì)照組。ELISA檢測(cè)各免疫組血清IgG的動(dòng)態(tài)變化水平；脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠體內(nèi)CD4<'+>、CD8<'+>淋巴細(xì)胞的變化。給予鏈球菌攻擊評(píng)價(jià)Fba蛋白及質(zhì)粒對(duì)免疫小鼠的保護(hù)功效。 結(jié)果： 1 PCR方法獲得了Fba基因，測(cè)序正確后，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2/fba和真核表達(dá)

6、質(zhì)粒pcDNA3.1/fba。 2 在大腸桿菌中成功表達(dá)了Fba重組蛋白，表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在。ELISA和Western-blot證實(shí)表達(dá)的Fba重組蛋白可與已知兔抗Fba陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)。 3 Fba蛋白可與GAS全菌免疫鼠血清、抗鏈"O"陽性病人血清發(fā)生特異性結(jié)合，盡管Fba蛋白做為診斷抗原的檢測(cè)結(jié)果比M蛋白的檢測(cè)結(jié)果的OD值小，但二者的檢測(cè)結(jié)果一致，均為陽性。 4 質(zhì)粒或蛋白免疫后小鼠I

7、gG產(chǎn)生水平以Fba蛋白免疫組增高最為明顯，依次為Fba質(zhì)粒蛋白混合免疫組及Fba質(zhì)粒組。特異性抗原誘導(dǎo)后體外脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示：pcDNA3.1/fba免疫組增值水平明顯高于其它組，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與此一致，并顯示CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞水平較對(duì)照組有顯著性增高。 5 鏈球菌攻擊后，PBS組小鼠在4天內(nèi)全部死亡，而Fba蛋白組、pcDNA3.1/fa+Fba蛋白組及M蛋白組在14天的觀察期內(nèi)均有60％的存活率，p

8、cDNA3.1/fba組為40％。 結(jié)論： 1 成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2/fba和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/fba。 2 在大腸桿菌中高效表達(dá)了Fba重組蛋白。 3 GAS感染可以誘導(dǎo)人體及動(dòng)物體產(chǎn)生Fba抗體，即Fba蛋白與M蛋白一樣，也具有良好的免疫原性和抗原特異性。因M蛋白及M抗體是人體感染GAS后誘發(fā)超敏反應(yīng)的主要原因，加之其血清型的多樣性，使M蛋白作為GAS的候選疫苗受到限制