化膿性鏈球菌表面蛋白Fba的免疫原性研究.pdf

1、目的： A族鏈球菌(GAS)是一類分布廣泛的致病菌，能引起多種臨床疾病，包括從喉或皮膚的淺表感染到高度侵襲及具有潛在致死的感染，甚至感染后嚴重的超敏反應腎小球腎炎、風濕性心臟病等。這些疾病都是由鏈球菌對呼吸道及皮膚的上皮細胞的黏附引起的。GAS可以通過其菌體表面蛋白與人血漿纖連蛋白(Fibronectin)結合，并以此為分子橋梁再與上皮細胞上的相關受體結合，介導細菌進入細胞，從而逃避宿主細胞對它的吞噬和殺傷<'[1]>。

2、 Fba蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的表達于GAS表面的蛋白，它至少存在于18個血清型中，并具有結合FHL-1、FH和纖連蛋白的能力。研究表明，F(xiàn)ba蛋白有助于GAS的抗吞噬，與FHL-1結合后能促進GAS進入人體上皮細胞，是一種重要的毒力因子<'[2，3]>。鑒于此，本課題選取了Fba蛋白編碼基因為研究對象，構建了Fba原核表達質(zhì)粒和真核表達質(zhì)粒，之后誘導原核質(zhì)粒表達，通過Western blot和ELISA檢測重組蛋白。并將真核表達質(zhì)粒和純化的

3、重組Fba蛋白免疫小鼠，對它們所誘導的體液免疫和細胞免疫進行評估，以進一步對其免疫原性及Fba在抗GAS感染免疫中的作用進行分析，為進一步研制以其為基礎的診斷試劑和疫苗提供依據(jù)。 方法： 1 PCR方法擴增Fba基因，克隆至pMD18-T載體上進行測序，測序正確后，經(jīng)BamHI、EcoRI和BamHI、XhoI雙酶切后，將其分別克隆至原核表達質(zhì)粒pGEX4T-2和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1。 2 原核表達質(zhì)

4、粒通過IPTG誘導，獲得了高效表達的蛋白包涵體，采用從SDS凝膠上電洗脫回收的方法進行純化回收，Western-blot和ELISA鑒定表達的目的蛋白。 3 以該蛋白作為抗原包被酶聯(lián)板檢測GAS全菌免疫鼠血清，未免疫鼠血清，抗鏈"O"陽性病人血清及健康志愿者血清中可能存在的Fba抗體，同時以GAS的M蛋白包板檢測以上各類血清中的M抗體作為陽性對照。 4 雌性BALB/c小鼠隨機分成6組，分別為Fba蛋白免疫組、M蛋白免疫

5、組、pcDNA3.1/fba+Fba.蛋白免疫組、pcDNA3.1/fba免疫組、pcDNA3.1空質(zhì)粒對照組及PBS對照組。ELISA檢測各免疫組血清IgG的動態(tài)變化水平；脾細胞增殖試驗及流式細胞術檢測小鼠體內(nèi)CD4<'+>、CD8<'+>淋巴細胞的變化。給予鏈球菌攻擊評價Fba蛋白及質(zhì)粒對免疫小鼠的保護功效。 結果： 1 PCR方法獲得了Fba基因，測序正確后，成功構建了原核表達質(zhì)粒pGEX4T-2/fba和真核表達

6、質(zhì)粒pcDNA3.1/fba。 2 在大腸桿菌中成功表達了Fba重組蛋白，表達蛋白主要以包涵體形式存在。ELISA和Western-blot證實表達的Fba重組蛋白可與已知兔抗Fba陽性血清產(chǎn)生特異性反應。 3 Fba蛋白可與GAS全菌免疫鼠血清、抗鏈"O"陽性病人血清發(fā)生特異性結合，盡管Fba蛋白做為診斷抗原的檢測結果比M蛋白的檢測結果的OD值小，但二者的檢測結果一致，均為陽性。 4 質(zhì)?；虻鞍酌庖吆笮∈驣

7、gG產(chǎn)生水平以Fba蛋白免疫組增高最為明顯，依次為Fba質(zhì)粒蛋白混合免疫組及Fba質(zhì)粒組。特異性抗原誘導后體外脾細胞增殖試驗顯示：pcDNA3.1/fba免疫組增值水平明顯高于其它組，流式細胞檢測結果與此一致，并顯示CD4<'+>、CD8<'+>T細胞水平較對照組有顯著性增高。 5 鏈球菌攻擊后，PBS組小鼠在4天內(nèi)全部死亡，而Fba蛋白組、pcDNA3.1/fa+Fba蛋白組及M蛋白組在14天的觀察期內(nèi)均有60％的存活率，p

8、cDNA3.1/fba組為40％。 結論： 1 成功構建了原核表達質(zhì)粒pGEX4T-2/fba和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/fba。 2 在大腸桿菌中高效表達了Fba重組蛋白。 3 GAS感染可以誘導人體及動物體產(chǎn)生Fba抗體，即Fba蛋白與M蛋白一樣，也具有良好的免疫原性和抗原特異性。因M蛋白及M抗體是人體感染GAS后誘發(fā)超敏反應的主要原因，加之其血清型的多樣性，使M蛋白作為GAS的候選疫苗受到限制