抗無乳鏈球菌中藥的篩選及鹽酸小檗堿抗無乳鏈球菌作用機理的初步研究.pdf

1、無乳鏈球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一，患有乳房炎的奶牛會影響牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì)，目前奶牛乳房炎的主要治療手段是使用抗生素療法，但抗生素易使細菌產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果。中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、高效低毒、低殘留的優(yōu)勢。因此本研究對20味中藥的有效成分進行提取，篩選出抗無乳鏈球菌最優(yōu)的中藥，對其單味中藥進行提取工藝的優(yōu)化，在最佳提取工藝條件下，研究黃連提取物對引致奶牛乳房炎的主要致病菌的體外抑菌活性，然后以抑菌效果最優(yōu)的中藥有效成分的單體物質(zhì)

2、為研究對象，進行抗無乳鏈球菌的抑菌機理的初步研究。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、抗無乳鏈球菌中藥的篩選:采用乙醇回流法和超聲波法提取20味中藥的有效成分，測定黃連等20味中藥提取物對無乳鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。20味中藥提取物的體外抗菌活性結(jié)果表明:黃連、虎杖、地榆和黃

3、芩4味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為7.8mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、烏梅、茵陳、秦皮、艾葉和紫花地丁6味中藥提取物的MIC值范圍為31.25mg/mL～62.5mg/mL，MBC值范圍為62.5mg/mL～125mg/mL;黃柏、魚腥草和白頭翁3味中藥提取物的MIC值和MBC值均為125mg/mL;苦參、金銀花、穿心蓮、杜仲、連翹、夏枯草和何首烏7味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為250mg/mL～500mg

4、/mL。
　　結(jié)論:篩選出黃連提取物對無乳鏈球菌具有最好的體外抑菌效果。
　　2、黃連抗無乳鏈球菌的最優(yōu)提取工藝及體外抑菌活性研究:采用正交設計，以浸膏得率及對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)為指標，對黃連提取工藝條件進行優(yōu)選研究，在黃連的最佳提取工藝條件下，測定黃連提取物對奶牛乳房炎的主要致病菌即無乳鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工藝結(jié)果表明，黃連的最佳提取工藝為

5、料液比1∶8，80％乙醇濃度回流提取2次，每次1.5h。黃連體外抑菌活性實驗結(jié)果表明，黃連提取物對無乳鏈球菌的MIC值和MBC值均為3.9mg/mL，對大腸桿菌的MIC值和MBC值分別為62.5mg/mL和125mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值均為31.25mg/mL。
　　結(jié)論:在最佳提取工藝下的黃連提取物抑菌效果提高，且對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。
　　3、鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)及

6、乳酸脫氫酶活性的影響:利用平板稀釋法繪制出鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌的抑菌曲線，通過透射電子顯微鏡觀察鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌超微結(jié)構(gòu)的影響，測定乳酸脫氫酶(LDH)活力研究鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌酶活性的影響。抑菌曲線結(jié)果表明，在MIC濃度下，鹽酸小檗堿能夠抑制細菌的生長;在2MIC濃度下，鹽酸小檗堿能在4h內(nèi)將細菌全部殺死。透射電鏡結(jié)果表明，正常組無乳鏈球菌細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，從內(nèi)到外可見層次分明的核區(qū)，細胞膜和細胞壁。在鹽酸小檗堿的作用下，

7、細胞形狀變得不規(guī)則，細胞膜、細胞壁逐漸溶解，膜壁界限變得模糊，細胞質(zhì)嚴重外流，核區(qū)不清晰，細胞質(zhì)解體內(nèi)出現(xiàn)空腔。測定酶活力實驗結(jié)果表明，經(jīng)過藥物作用后，乳酸脫氫酶活力下降。
　　結(jié)論:鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌的抑菌曲線呈現(xiàn)了濃度時間的相關(guān)性。鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌的結(jié)構(gòu)有較強的破壞作用，隨著時間的延長破壞加劇，且可以降低乳酸脫氫酶的活性。
　　4、鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響:通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SD

8、S-PAGE)實驗和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)核酸熒光染色法研究鹽酸小檗堿對無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響。SDS-PAGE結(jié)果表明，正常無乳鏈球菌蛋白譜帶多且清晰，而經(jīng)藥物作用后，蛋白譜帶變淺，有的譜帶甚至消失;DAPI染色實驗結(jié)果表明，正常無乳鏈球菌DNA熒光強度較強，且熒光點較多，經(jīng)過藥物作用后DNA熒光強度明顯減弱。
　　結(jié)論:鹽酸小檗堿可以影響蛋