抗無乳鏈球菌中藥的篩選及鹽酸小檗堿抗無乳鏈球菌作用機(jī)理的初步研究.pdf

1、無乳鏈球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一，患有乳房炎的奶牛會(huì)影響牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì)，目前奶牛乳房炎的主要治療手段是使用抗生素療法，但抗生素易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果。中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、高效低毒、低殘留的優(yōu)勢(shì)。因此本研究對(duì)20味中藥的有效成分進(jìn)行提取，篩選出抗無乳鏈球菌最優(yōu)的中藥，對(duì)其單味中藥進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，在最佳提取工藝條件下，研究黃連提取物對(duì)引致奶牛乳房炎的主要致病菌的體外抑菌活性，然后以抑菌效果最優(yōu)的中藥有效成分的單體物質(zhì)

2、為研究對(duì)象，進(jìn)行抗無乳鏈球菌的抑菌機(jī)理的初步研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1、抗無乳鏈球菌中藥的篩選:采用乙醇回流法和超聲波法提取20味中藥的有效成分，測(cè)定黃連等20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)。20味中藥提取物的體外抗菌活性結(jié)果表明:黃連、虎杖、地榆和黃

3、芩4味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為7.8mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、烏梅、茵陳、秦皮、艾葉和紫花地丁6味中藥提取物的MIC值范圍為31.25mg/mL～62.5mg/mL，MBC值范圍為62.5mg/mL～125mg/mL;黃柏、魚腥草和白頭翁3味中藥提取物的MIC值和MBC值均為125mg/mL;苦參、金銀花、穿心蓮、杜仲、連翹、夏枯草和何首烏7味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為250mg/mL～500mg

4、/mL。
　　結(jié)論:篩選出黃連提取物對(duì)無乳鏈球菌具有最好的體外抑菌效果。
　　2、黃連抗無乳鏈球菌的最優(yōu)提取工藝及體外抑菌活性研究:采用正交設(shè)計(jì)，以浸膏得率及對(duì)無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)為指標(biāo)，對(duì)黃連提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選研究，在黃連的最佳提取工藝條件下，測(cè)定黃連提取物對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌即無乳鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工藝結(jié)果表明，黃連的最佳提取工藝為

5、料液比1∶8，80％乙醇濃度回流提取2次，每次1.5h。黃連體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃連提取物對(duì)無乳鏈球菌的MIC值和MBC值均為3.9mg/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC值和MBC值分別為62.5mg/mL和125mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值均為31.25mg/mL。
　　結(jié)論:在最佳提取工藝下的黃連提取物抑菌效果提高，且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。
　　3、鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)及

6、乳酸脫氫酶活性的影響:利用平板稀釋法繪制出鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的抑菌曲線，通過透射電子顯微鏡觀察鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌超微結(jié)構(gòu)的影響，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活力研究鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌酶活性的影響。抑菌曲線結(jié)果表明，在MIC濃度下，鹽酸小檗堿能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng);在2MIC濃度下，鹽酸小檗堿能在4h內(nèi)將細(xì)菌全部殺死。透射電鏡結(jié)果表明，正常組無乳鏈球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，從內(nèi)到外可見層次分明的核區(qū)，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。在鹽酸小檗堿的作用下，

7、細(xì)胞形狀變得不規(guī)則，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁逐漸溶解，膜壁界限變得模糊，細(xì)胞質(zhì)嚴(yán)重外流，核區(qū)不清晰，細(xì)胞質(zhì)解體內(nèi)出現(xiàn)空腔。測(cè)定酶活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過藥物作用后，乳酸脫氫酶活力下降。
　　結(jié)論:鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的抑菌曲線呈現(xiàn)了濃度時(shí)間的相關(guān)性。鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的破壞作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)破壞加劇，且可以降低乳酸脫氫酶的活性。
　　4、鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響:通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SD

8、S-PAGE)實(shí)驗(yàn)和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)核酸熒光染色法研究鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響。SDS-PAGE結(jié)果表明，正常無乳鏈球菌蛋白譜帶多且清晰，而經(jīng)藥物作用后，蛋白譜帶變淺，有的譜帶甚至消失;DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常無乳鏈球菌DNA熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，且熒光點(diǎn)較多，經(jīng)過藥物作用后DNA熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　結(jié)論:鹽酸小檗堿可以影響蛋