無乳鏈球菌跨宿主感染機(jī)制的比較基因組學(xué)研究.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）又稱B組鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)可感染包括人、奶牛、魚等在內(nèi)的多種宿主。GBS感染人可引起孕婦早產(chǎn)、新生兒敗血癥和腦膜炎、成年人軟組織感染和腦膜炎，感染奶牛造成奶牛乳腺炎嚴(yán)重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，感染魚類引起腦膜腦炎造成大面積養(yǎng)殖魚類死亡。牛奶和魚類是人類重要的食物蛋白來源，規(guī)模化養(yǎng)殖的奶牛和魚類與人類接觸密切，而人對GBS的高攜帶率，造成

2、GBS在人、牛和魚間的跨宿主感染風(fēng)險(xiǎn)極高。但目前臨床人?；蛉唆~間是否存在交叉感染或牛和魚是否可作為感染人GBS的儲存池及人源GBS是否在牛和魚進(jìn)行傳播還未有定論。因此，有必要對GBS跨宿主感染風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估并研究其跨宿主感染機(jī)制。
　　基因水平轉(zhuǎn)移促進(jìn)了細(xì)菌基因組的快速演變，并可能參與菌種的形成。GBS種內(nèi)或種間基因組重組頻繁發(fā)生并且可發(fā)生基因組大片段的交換，造成GBS基因組呈馬賽克結(jié)構(gòu)，是GBS遺傳分化的主要驅(qū)動力?？梢苿舆z傳元件

3、(MGEs)包括結(jié)合性質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子和整合接合元件(ICEs)等。通過基因水平轉(zhuǎn)移可造成GBS種內(nèi)基因組分化和毒力克隆的出現(xiàn)，影響GBS的生態(tài)位和宿主適應(yīng)性。對毒力差異和宿主特異性的GBS菌株進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，可快速獲得非必需基因、基因缺失或突變、差異表達(dá)蛋白等相關(guān)信息，是研究GBS跨宿主感染、致病性和免疫原性的有效途徑。
　　因此，本研究首先對在廣西地區(qū)收集的92株人源致病性GBS進(jìn)行了莢膜血清型、MLST、PFGE、

4、抗生素抗性和毒力相關(guān)基因分析，通過動物感染試驗(yàn)及病理組織切片研究人源GBS對羅非魚的致病性，進(jìn)而有針對性的對跨宿主感染能力不同的人源GBS菌株開展基因組測序、泛基因組、全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因組序列變異分析、CRISPRs結(jié)構(gòu)和前噬菌體分析等比較基因組學(xué)研究，探討GBS的跨宿主感染機(jī)制。主要取得以下結(jié)果:
　　1.92株人源GBS分別來源于19種疾病，其中來源婦女菌株最多，占總菌株數(shù)的75％。MLST分析發(fā)現(xiàn)CC103菌株比例極

5、顯著升高(20株，21.74％)，特別是ST485（13株，14.13％）可感染包括新生兒在內(nèi)造成多種疾病;發(fā)現(xiàn)3株被認(rèn)為是特異性感染奶牛的CC67菌株，并且重組獲得了ST17菌株特有超強(qiáng)毒力基因gbs2018C。牛源和人源CC103菌株交錯構(gòu)成獨(dú)立進(jìn)化分枝，3株人源CC67菌株與特異性感染奶牛的ST61和ST67菌株聚為同一進(jìn)化分枝。
　　2.92株人源GBS跨宿主感染羅非魚，發(fā)病羅非魚表現(xiàn)出體色發(fā)黑、出血、轉(zhuǎn)圈等典型癥狀，病理

6、組織切片分析發(fā)現(xiàn)GBS可突破血腦屏障進(jìn)入腦組織并大量增殖。同時發(fā)現(xiàn)所有ST23菌株（21株，22.83％）對羅非魚具有高致病性，而ST19菌株對羅非魚致病性與菌株血清型存在關(guān)聯(lián)，17株血清型Ⅲ的CC19菌株對羅非魚的致病力全部較弱或無致病性，而11株血清型Ⅴ的CC19菌株和1株血清型Ⅱ的CC19菌株對羅非魚的致病力全部較強(qiáng)。2株人源致病性ST1菌株對羅非魚致病性截然不同，NNA048對羅非魚的致病力與羅非魚源GBS無差異，而NNA038

7、對羅非魚確無致病力。
　　3.比較基因組學(xué)研究顯示牛源和人源的GBS CC103菌株具有很近的親緣關(guān)系，CC103菌株在人和牛交叉?zhèn)鞑ゲ⑦M(jìn)化出多個菌群進(jìn)化分枝，其中ST485菌群進(jìn)化分枝的菌株特異性感染人且具有高致病力，該菌群菌株相對其他CC103菌株基因組均發(fā)生Lac.2缺失和CadDX基因獲得。
　　4.羅非魚高致病力和無致病力ST23GBS菌株基因組比較和前噬菌體分析結(jié)果顯示菌株間的差異主要為前噬菌體序列。其中P1區(qū)域

8、的前噬菌體GC含量為43％左右，編碼28～39個蛋白，介導(dǎo)GBS通過噬菌體重組獲得細(xì)菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的YafQ/DinJ結(jié)構(gòu)。具有該前噬菌體的ST23GBS對羅非魚無致病性，而不具有該前噬菌體或該前噬菌體發(fā)生了基因變異或缺失（特別是缺失YafQ/DinJ結(jié)構(gòu)）ST23GBS對羅非魚具有高致病性。羅非魚高致病力和無致病力ST1GBS菌株NNA048和NNA038基因組比較結(jié)果顯示基因組差異主要為噬菌體序列差異，NNA048基因組特異具有

9、一個長度為49.8kb編碼68個蛋白的完整噬菌體序列，基因組間共有96個SNVs和6個indels。
　　5.GBS ST19血清型Ⅲ菌株的核心基因數(shù)量比例(67.09％)低于血清型Ⅴ菌株(70.59％)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示Ⅲ型菌株間的進(jìn)化距離比Ⅴ型菌株間的進(jìn)化距離更遠(yuǎn)。血清型Ⅲ菌株的CRISPRs結(jié)構(gòu)比血清型Ⅴ菌株的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，插入序列數(shù)量和類型均多于Ⅴ型菌株?；蚪M比較結(jié)果顯示血清型Ⅲ菌株和血清型Ⅴ菌株的莢膜多糖區(qū)域（約11

10、1kb）及與其毗鄰的ICEs區(qū)域（約106kb）發(fā)生了大片段重組。莢膜多糖區(qū)域包括整個莢膜多糖操縱子。血清型Ⅲ菌株的ICEs區(qū)域包含具有mega element的ICE且菌株間變異較大，而血清型Ⅴ菌株的ICEs region包含具有IQ element和erm(TR)的ICEs且菌株間非常保守。
　　綜上所述，本研究首先明確了人源不同血清型、CC群或ST型GBS對羅非魚的致病性及部分菌株與牛源菌株的關(guān)系，然后通過比較基因組學(xué)探討了