水稻稃片失綠突變體及其Ds標(biāo)簽基因的鑒定.pdf

1、隨著水稻基因組全核苷酸序列測(cè)定工作的完成，功能基因組學(xué)研究已經(jīng)成為水稻分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。開(kāi)展水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位、克隆和功能分析等方面的研究，對(duì)于水稻和其它禾本科植物都具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。突變體庫(kù)的構(gòu)建是功能基因組學(xué)研究的一條重要的途徑。近年來(lái)，利用插入突變構(gòu)建突變體庫(kù)的方法得到了廣泛應(yīng)用，Ac/Ds標(biāo)簽系統(tǒng)構(gòu)建插入突變體庫(kù)是最常用的方法之一。
　　本研究從粳稻品種Dongjin（Oryza sat

2、iva L. var. Japonica cv. Dongjin）的Ac/Ds插入突變株系中發(fā)現(xiàn)了一例稃片失綠突變體，對(duì)突變體植株表型進(jìn)行了初步的形態(tài)和生理學(xué)鑒定；同時(shí)，利用TAIL-PCR技術(shù)分離了突變體Ds插入部位的側(cè)翼序列，并利用生物信息學(xué)分析對(duì)其進(jìn)行染色體定位和相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)。此外，基于多重 PCR技術(shù)對(duì)突變體后代的 Ds插入進(jìn)行了基因型分析。本研究取得了以下主要結(jié)果：
　　與野生型水稻相比，稃片失綠突變體表現(xiàn)為

3、植株抽穗后內(nèi)稃和外稃均呈白色，其它部位（如葉片、穗軸及小梗）均呈正常的綠色，成熟后稃片轉(zhuǎn)黃。隨機(jī)選取突變體和野生型水稻各100株，測(cè)量比較兩者在株高、分蘗數(shù)、千粒重等指標(biāo)上的差異，并通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，稃片失綠突變體在株高、分蘗數(shù)上與野生型均有顯著差異。同時(shí)，分析突變體與野生型抽穗期稃片中葉綠素的含量，結(jié)果顯示，與野生型相比，突變體抽穗期稃片中葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素含量均顯著降低。
　　采用TAIL-PCR技術(shù)，從

4、稃片失綠突變體基因組DNA中擴(kuò)增并分離出Ds插入部位的2條側(cè)翼序列。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析，對(duì)Ds的插入位點(diǎn)進(jìn)行了染色體定位。以Ds側(cè)翼序列為待查詢(xún)序列進(jìn)行 NCBI-BLAST在線分析，同源比對(duì)結(jié)果顯示，兩個(gè)序列分別與水稻第3號(hào)染色體上的克隆B1339A06(GenBank:AC148339.1; GI:42761480)及第12號(hào)染色體上的 BAC克隆 OSJNBa0030G16(GenBank:AL713943.3；GI:2

5、2003255)序列高度一致。
　　以Ds插入位點(diǎn)為基點(diǎn)，分別從該克隆獲取長(zhǎng)10 kb的長(zhǎng)序列，用FGENESH和 GeneMark.hmm兩種軟件分別對(duì)Ds插入位點(diǎn)的下游基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得外顯子的數(shù)目、大小、位置。分析結(jié)果表明，兩個(gè)Ds插入位點(diǎn)均為非編碼序列。在3號(hào)染色體上Ds插入位點(diǎn)的下游基因編碼164個(gè)氨基酸，Ds插入在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游994 bp處。在12號(hào)染色體上Ds插入位點(diǎn)的下游基因編碼680個(gè)氨基酸， Ds插入

6、在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游14213 bp處。利用預(yù)測(cè)的氨基酸序列，進(jìn)行 NCBI Entrez server和Pfam在線比對(duì)，對(duì)下游基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，推測(cè)基因的編碼產(chǎn)物。結(jié)果顯示，推測(cè)3號(hào)染色體 Ds插入位點(diǎn)的下游基因編碼產(chǎn)物為遍在脅迫蛋白（USP）家族，12號(hào)染色體上Ds插入位點(diǎn)的下游基因編碼產(chǎn)物為逆轉(zhuǎn)座子gag蛋白（Retrotransposon gag protein）。
　　根據(jù)3號(hào)染色體上Ds插入位點(diǎn)兩端的核苷酸序列以及Ds