RNAi介導(dǎo)的抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻研究.pdf

1、水稻條紋葉枯病是熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的病毒病之一.在我國(guó)的粳稻產(chǎn)區(qū)一般會(huì)造成20～30﹪的減產(chǎn).近年來，由于氣候和耕作的變化以及水稻品種的抗病性較差,我國(guó)江蘇、山東、河南等地種植的水稻遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.水稻條紋葉枯病由水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起,RSV是是纖細(xì)病毒屬 (Tenuivirus) 的代表種,主要由灰飛虱 (Laodelphax striatellusFallen)及其它3種飛虱持久性傳

2、播.RSV在電鏡下觀察呈絲狀粒體,以折疊、分枝和超螺旋等形式存在.RSV在寄主植物和介體昆蟲體內(nèi)都能進(jìn)行復(fù)制.RNAi是一種重要基因沉默現(xiàn)象,當(dāng)表達(dá)來源于病毒某一基因或核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生RNA沉默時(shí),能對(duì)入侵的同一病毒或同屬中相近病毒的RNA進(jìn)行降解,使入侵的病毒不能在植物中積累,從而賦予轉(zhuǎn)基因植物病毒抗性.本文對(duì)我國(guó)北方34個(gè)RSV分離物CP基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室分析,結(jié)果表明：CP基囚的核苷酸序列一致性在96.8～100﹪之間,說

3、明我國(guó)北方粳稻產(chǎn)區(qū)所發(fā)生的RSV CP基因非常保守,有利于siRNA的識(shí)別.因此,本文探索利用RNAi原理構(gòu)建RSV CP基囚全長(zhǎng)片段或部分片段介導(dǎo)的干涉載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻,篩選對(duì)水稻條紋病毒產(chǎn)生抗性的轉(zhuǎn)基因水稻后代,利用品種自身的抗性達(dá)到主動(dòng)防治的目的. 本文首先利用pMCG161載體上的多克隆位點(diǎn)將RSV CP全長(zhǎng)或部分片段的正義鏈、反義鏈、正反鏈分別連接到載體上,其中正反鏈之間由一段載體上的內(nèi)含子作為間隔,

4、從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu).再根據(jù)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的需要,將初步構(gòu)建的載體上包含目的基因結(jié)構(gòu)的片段酶切后連接到水稻轉(zhuǎn)化常用載體pCAMBIA1301,最終構(gòu)建成適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的載體,構(gòu)建了含RSV CP全長(zhǎng)和部分基因片段的正義鏈、反義鏈和正反義干涉載體.此外,通過對(duì)pMCG161空載體和pCAMBIA1301載體的改造,構(gòu)建了既可用于干涉,又能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化成一種新載體.利用農(nóng)桿菌EHA105的介導(dǎo)將構(gòu)建的

5、干涉載體轉(zhuǎn)入水稻模式品種愛知旭和推廣品種皖粳97及秀水11的成熟胚愈傷組織,利用PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)化得到的水稻進(jìn)行目的基因檢測(cè),初步鑒定獲得以愛知旭為受體的T0代轉(zhuǎn)基囚水稻8棵(其中轉(zhuǎn)p1301=CP載體5棵,轉(zhuǎn)p1301=HCP載體3棵),皖粳97為受體的TO代轉(zhuǎn)基因水稻1棵(轉(zhuǎn)p1301=CP載體),秀水11為受體的T0代轉(zhuǎn)基因水稻2棵(轉(zhuǎn)p1301=CP載體).對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻再進(jìn)行GUS、NOS、35S、HPT等幾種載體上存在的元件進(jìn)

6、行檢測(cè),初步判斷轉(zhuǎn)入水稻的元件基因是否發(fā)生丟失.對(duì)皖粳97轉(zhuǎn)基因水稻的后代隨機(jī)抽取樣品(T1代20棵、T2代約66棵)進(jìn)行目的基因檢測(cè)和元件檢測(cè),初步鑒定其中的70棵為陽性轉(zhuǎn)基因水稻后代. 為了保證接種壓力,首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的帶毒灰飛虱種群進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得其帶毒率為93.40﹪.利用帶毒灰飛虱進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn),每株水稻接種10-12頭灰飛虱,接種7天后將灰飛虱轉(zhuǎn)移或殺死,將植株移栽大田或溫室.對(duì)獲得的愛知旭為受體的轉(zhuǎn)基因水稻(T0)及

7、其后代(T1)和皖粳97為受體的轉(zhuǎn)基因水稻(T0)及其后代(T1、T2)進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn),接種后大約55-60天進(jìn)行抗病性調(diào)查.病情調(diào)查結(jié)果表明,T0代轉(zhuǎn)基因愛知旭水稻有5棵表現(xiàn)高抗,有2棵表現(xiàn)免疫.與非轉(zhuǎn)基因水稻皖粳97相比,轉(zhuǎn)基因皖粳97植株發(fā)病延遲,大部分轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病癥狀明顯減輕或者未出現(xiàn)癥狀.參照抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性分析,對(duì)照皖粳97植株表現(xiàn)高感,T2代皖粳97為受體的轉(zhuǎn)基因水稻中的3個(gè)株系表現(xiàn)中感,7個(gè)株系表現(xiàn)中抗,5個(gè)株系

8、表現(xiàn)高抗(其中3個(gè)株系的T1代植株表現(xiàn)免疫).通過對(duì)T0、T1、T2代皖粳97轉(zhuǎn)基因植株的連續(xù)抗病性調(diào)查,可以看出T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)RSV的抗性可以遺傳給T2后代.接種后發(fā)病等級(jí)為0的轉(zhuǎn)基因水稻植株中病毒CP的含量及其mRNA積累量與非轉(zhuǎn)基因水稻相比明顯較低. 文中抽取不同轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行外源插入結(jié)構(gòu)的左右邊界分析，以及其旁側(cè)序列測(cè)定.轉(zhuǎn)基因秀水11水稻0-1具有不完整的左邊界和右邊界,通過右邊界的序列分析初步推測(cè)在0-1中外源片