柑橘黃龍病寄生植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析及相關(guān)性研究.pdf

1、柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)嚴(yán)重威脅并阻礙著我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。該病害由寄生于韌皮部篩管細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌引起，目前認(rèn)為該病菌屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的候選韌皮桿菌屬(CandidatusLiberibacter)，是一種難培養(yǎng)原核微生物。迄今為止，柑橘黃龍病菌的體外培養(yǎng)仍然是攻克黃龍病的難點(diǎn)，為克服傳統(tǒng)的純培養(yǎng)研究思路，欲建立柑橘黃龍病菌的共培養(yǎng)體系，本研究以

2、獲取功能型植物伴生性內(nèi)生細(xì)菌為目的，對(duì)長(zhǎng)春花病、健植株及九里香健株的內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行多樣性分析并對(duì)其功能進(jìn)行初步的鑒定。以揭示九里香及黃龍病菌侵染長(zhǎng)春花后體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，為尋找柑橘黃龍病菌能在其寄主體內(nèi)大量增殖的內(nèi)在原因及其侵染機(jī)理并利用功能性內(nèi)生細(xì)菌病害防治研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 ①以顯癥的3年生長(zhǎng)春花植株及健康長(zhǎng)春花植株樣品為材料，利用兼性厭氧可培養(yǎng)技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(Restriction f

3、ragment length polymorphism，RFLP)及16S rDNA序列分析相結(jié)合的方法。分別從感病和健康長(zhǎng)春花葉、莖、根的組織中分離獲得67株內(nèi)生細(xì)菌，與GenBank中29種細(xì)菌的相似性達(dá)到97％-100％。其中短小桿菌屬(Curtobacterium sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)為感病長(zhǎng)春花內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群，鞘胺醇單胞菌屬Brevundimonas

4、 sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)為健康長(zhǎng)春花內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群；馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)為兩者的共同優(yōu)勢(shì)菌群。
　　 通過(guò)RFLP方法分析，感病株得到16個(gè)、健株得到23個(gè)操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic units，OTus)，感病植株中存在柑橘黃龍病菌CandidatusLiberibacter asiaticus和豐富的Candidatus Li

5、beribacter sp.。
　　 經(jīng)一系列功能鑒定，測(cè)定了29株內(nèi)生細(xì)菌的功能，其中18株菌能產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(IAA)；具有抗生素(phlD)合成能力的內(nèi)生細(xì)菌有1株；結(jié)合nifH歸和NFb固氮培養(yǎng)基確定有4株內(nèi)生細(xì)菌具有固氮能力；8株內(nèi)生細(xì)菌具有ACC脫氨酶合成能力；11株內(nèi)生細(xì)菌具有鐵細(xì)胞合成能力；5株內(nèi)生細(xì)菌具有淀粉水解能力；7株內(nèi)生細(xì)菌顯示強(qiáng)陽(yáng)性的蛋白酶合成能力。6株內(nèi)生細(xì)菌具有以上4種功能，分屬于馬胃葡萄球菌、

6、芽孢桿菌屬、短小桿菌屬、摩氏摩根菌屬(Morganella morganii)及溶桿菌屬(Lysobacter sp.)5個(gè)屬。
　　 ②以生長(zhǎng)在福州、廈門(mén)、廣州、廣西等黃龍病高發(fā)區(qū)的多年生九里香植株葉及莖桿為分離對(duì)象，利用平板培養(yǎng)法及基于16S rDNA的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)序列分子鑒定法，對(duì)九里香植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析。在兼性厭氧的生長(zhǎng)環(huán)境下，獲得可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌26株，屬于5個(gè)不同的類(lèi)群，低G+C革蘭氏陽(yáng)性菌

7、(Firmicutes)為主要類(lèi)群，占內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的50％，其次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)，包括α、γ2個(gè)類(lèi)型，分別占7.7％、30.77％；擬桿細(xì)菌(Bacteroidetes)占7.7％；放線細(xì)菌(Actinobacteria)占3.85％。26株細(xì)菌分屬于9個(gè)細(xì)菌屬的14個(gè)種，分別為腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium s

8、p.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)、短波單胞菌屬(Brevu

9、ndimonas sp.)、單胞菌屬(Sphingomonas sp.)、短小桿菌屬(Curtobacterium sp.)。其中腸桿菌屬(Enterobacter sp.)(IF=19.23％)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)(IF=38.46％)為九里香可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　 利本研究選用細(xì)菌通用引物799F/1492r擴(kuò)增九里香細(xì)菌基因組的16S rDNA的V5-V9這5個(gè)高變區(qū)域并進(jìn)行RFLP分析。篩選

10、得到179個(gè)陽(yáng)性克隆，分別進(jìn)行HaeⅢ、MspⅠ、RsaⅠ三種限制性內(nèi)切酶分析，得到20個(gè)不同的操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，該克隆文庫(kù)的覆蓋度(Coverage C)為94.97％，結(jié)合Rarefaction曲線分析，表明所構(gòu)建的克隆文庫(kù)是相對(duì)充分的。沙雷氏菌屬(Serratia sp.)為九里香不可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬。
　　 利用生理生化鑒定的方法，測(cè)定了14株內(nèi)生細(xì)菌

11、的功能，其中9株菌能產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(IAA)；具有抗生素(phlD)合成能力的內(nèi)生細(xì)菌有4株；結(jié)合nifH和NFb固氮培養(yǎng)基確定有3株內(nèi)生細(xì)菌具有固氮能力；1株內(nèi)生細(xì)菌具有ACC脫氨酶合成能力；8株內(nèi)生細(xì)菌具有鐵細(xì)胞合成能力；3株內(nèi)生細(xì)菌具有淀粉水解能力；2株內(nèi)生細(xì)菌顯示強(qiáng)陽(yáng)性的蛋白酶合成能力。4株內(nèi)生細(xì)菌具有以上4種功能，分屬于Bacillusmegaterium、Bacillus pumilus、Paenibacillus sp