多環(huán)芳烴污染對植物內(nèi)生細菌分布及相關降解基因多樣性的影響.pdf

1、多環(huán)芳烴（PAHs）是一類在環(huán)境中廣泛存在的持久性有機污染物，其在土壤中易持留、難降解，嚴重影響農(nóng)產(chǎn)品安全，可通過食物鏈危害人群健康和生態(tài)安全。能否利用植物內(nèi)生細菌來調(diào)控植物體內(nèi)PAHs的代謝，進而規(guī)避植物有機污染風險、保障農(nóng)產(chǎn)品安全？這一問題已引起學者廣泛關注。了解污染區(qū)植物內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)及其與污染物降解相關基因的多樣性，這對于篩選出具有污染物降解功能的內(nèi)生細菌、更加有效地利用內(nèi)生細菌來消除植物污染風險等具有重要意義。然而遺憾的是

2、，國內(nèi)外迄今有關PAHs污染下植物內(nèi)生細菌的種群和群落結(jié)構(gòu)以及內(nèi)生細菌中與PAHs降解相關基因的研究仍幾近空白。
　　本研究采集了長期在PAHs污染區(qū)生長、距污染源不同距離且長勢較為一致的兩種常見植物一看麥娘和酢漿草，采用有機溶劑萃取法、高效液相色譜分析法(HPLC)、微生物學傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，結(jié)合現(xiàn)代分子生物學技術中變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）分析技術，研究了不同PAHs污染強度下兩種植物體內(nèi)內(nèi)生細菌的種群特性、群落結(jié)構(gòu)分

3、布及變化趨勢;分析了植物體內(nèi)與PAHs代謝相關基因的分布及多樣性;驗證了分離出的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌對常見PAHs的耐受性。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過傳統(tǒng)的涂布平板法，研究了不同PAHs污染區(qū)域兩種植物體內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的種群及數(shù)量變化。實驗結(jié)果顯示，在PAHs污染場地中生長的兩種植物體內(nèi)均存在有數(shù)量可觀的可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，但其種群多樣性并不高，同時PAHs污染水平可顯著影響可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的數(shù)量及種群特征。不同PAHs污染區(qū)兩種植

4、物體內(nèi)內(nèi)生細菌的數(shù)量為104到107 CFU·g-1（鮮重），隨著污染程度的增強，其數(shù)量不斷減少。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特征分析及16S rRNA基因序列同源性鑒定，從兩種植物體內(nèi)共分離出68株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，分別屬于14個屬，5個綱，3個門(Firmicutes、Proteobacteria及Bacteroidetes)。隨著PAHs濃度的變化，各種屬內(nèi)生細菌所占比例有所不同，但Bacillus spp.和Pseudomonas spp

5、.在不同程度的PAHs污染下均為兩種植物體內(nèi)可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群。對分離出的68株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌進行PAH耐受性驗證，結(jié)果表明，大多數(shù)內(nèi)生細菌對不同PAHs具有一定的耐受性，部分內(nèi)生細菌可利用供試的PAH為唯一碳源或能源進行生長。
　　(2)提取供試植物中內(nèi)生細菌的總DNA，采用PCR-DGGE技術揭示了PAHs污染區(qū)不同植物組織中內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性的動態(tài)。結(jié)果顯示，內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)取決于植物類型、植物組織以及土壤和

6、植物中PAHs的含量。不同污染區(qū)、不同植物組織中內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌群不盡相同，一般來說中低水平PAHs污染條件下植物內(nèi)生細菌具有較高的多樣性，且根組織中內(nèi)生細菌的多樣性要高于莖葉組織。如低污染區(qū)看麥娘根中內(nèi)生細菌的香農(nóng)-威爾指數(shù)(Shannon-Wiener Index)為3.38，而高污染區(qū)看麥娘莖葉中內(nèi)生細菌的香農(nóng)-威爾指數(shù)僅為2.74。實驗從兩種植物內(nèi)生細菌16S rRNA基因V3區(qū)的DGGE凝膠中分離、鑒定出77條序列，其中大部分

7、屬于不可培養(yǎng)細菌(uncultured bacteria)。通過系統(tǒng)進化分析可得，這77條序列分別屬于4個門:Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes。數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示，不論在何種PAHs污染條件下，Proteobacteria均為兩種供試植物體內(nèi)的優(yōu)勢菌群。
　　(3)選用萘雙加氧酶(NAH)基因和苯酚單加氧酶(PHE)基因這兩種與植物體內(nèi)PAHs代謝密切相關的