花生子葉再生體系及轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化.pdf

1、花生(Arachis hypogaea L.)是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，但花生容易受到病蟲害等不利因素的危害，從而影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。本論文選用花生品種農(nóng)大花410，農(nóng)大花416和遠(yuǎn)雜9102，建立花生子葉再生體系，誘導(dǎo)芽叢成苗、從篩選適宜Km濃度和探索適宜侵染的菌液濃度及侵染時間和共培養(yǎng)時間4個方面進(jìn)行提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生遺傳轉(zhuǎn)化效率。通過以上研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)體系，將外源基因轉(zhuǎn)入花生品種遠(yuǎn)雜9102中，獲得抗

2、Km的植株。通過PCR檢測證明外源基因已整合到花生基因組中。試驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.適宜誘導(dǎo)芽叢成苗的培養(yǎng)基激素配比：設(shè)置芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同激素濃度的配比，共15個處理。以子葉為外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽的形成，2周左右觀察叢生芽的誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，(1)基因型對再生率有很大影響，不同花生品種不定芽的形成有明顯的差異。(2)遠(yuǎn)雜9102子葉外植體在培養(yǎng)基MS+1mg/L2，4-D+0.3mg/LTDZ誘導(dǎo)芽叢效果最好，叢生

3、芽誘導(dǎo)率為70％。
　　 在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較3種芽伸長培養(yǎng)基，將帶有不定芽的愈傷組織轉(zhuǎn)至添加6-BA(0，2，4mg/L)的培養(yǎng)基上，促進(jìn)不定芽伸長形成植株，轉(zhuǎn)移2-4周后，觀察叢生芽成苗的效果，結(jié)果表明，在MS培養(yǎng)基上伸長培養(yǎng)芽叢成苗效果最好，花410，416和遠(yuǎn)雜9102不定芽形成植株率分別為84％，80％，76％，將再生小植株從基部切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上，使其生根長成完整植株。在MS+1mg//LNAA培養(yǎng)基上生

4、根效果較好。
　　 2.確定了Km的濃度，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加km的最適濃度為150mg/L可有效的抑制子葉不定芽的形成。添加300mg/L Cb可有效抑制農(nóng)桿菌LBA4404的生長，且對花生外植體的再生無顯著影響。
　　 3，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的適宜條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明：(1)菌液濃度對轉(zhuǎn)化率影響較大，以O(shè)D600=0.5為最好。(2)適宜侵染時間為15min，轉(zhuǎn)化率較高。(3)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間3d，轉(zhuǎn)化率較高。

5、r>　　 4.將GUS基因轉(zhuǎn)入9102花生品種中。利用優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以預(yù)培養(yǎng)2d的花生品種9102的子葉為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌LBA4404侵染，Km篩選和標(biāo)記基因PCR檢測，得到目的基因轉(zhuǎn)化植株。
　　 5.通過對組培和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究，提出農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)花生基因轉(zhuǎn)化的技術(shù)流程：選用花生品種遠(yuǎn)雜9102的成熟飽滿的種子。經(jīng)表面消毒后，取預(yù)培養(yǎng)2d的子葉，用活化的農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.5)浸染15min，黑