馬鹿精子體外獲能及獲能前后超微結構變化的研究.pdf

1、精子獲能是哺乳動物受精前必須經歷的一個成熟過程，所以精子的體外獲能便是實現(xiàn)體外受精的一個重要前提。本研究以馬鹿為試驗對象，開展了對鹿精子體外獲能以及獲能前后精子超微結構變化的研究，以期篩選出在實踐中具有可操作性且效果良好的馬鹿精子獲能培養(yǎng)體系，從而為鹿體外受精和受精機理的研究奠定基礎。 對馬鹿精子，使用上浮法誘導其獲能，通過對頂體染色測定精子的頂體反應率并作為主要指標，同時以精子活力、精子存活時間和異種受精率為輔助指標，對精子的

2、獲能效果進行評價，以比較不同培養(yǎng)溫度、丙酮酸鈉濃度、咖啡因濃度、肝素濃度以及培養(yǎng)基對馬鹿精子體外獲能效果的影響。研究結果如下： 1.采用上浮法可使馬鹿的精子體外獲能。其中精液與洗精液的適宜比例為1：3～5；兩次離心洗滌時的速度和時間以2200rpm×10min和2000rpm×5min為宜。2.使用改進的三色染色法可以有效地評價馬鹿精子獲能后的頂體反應水平。3.馬鹿精子于5％CO2、飽和濕度下獲能培養(yǎng)，38.5℃時的頂體反應率極

3、顯著高于37℃時的頂體反應率(P＜0.01)。4.BO液中丙酮酸鈉的濃度從0.5mM提高至1.25mM時，頂體反應率顯著降低(P＜0.05)。5.選擇TALP為基礎液對馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)，項體反應率顯著高于BO液(Ⅰ)與BO液(Ⅲ)(P＜0.05)；而BO液(Ⅰ)與BO液(Ⅲ)相比差異不顯著(P＞0.05)。6.以TALP為基礎液，結合使用6mg/mlBSA和10μg/ml肝素，5mM咖啡因的作用效果與0mM、2.5mM和10mM的相

4、比，頂體反應發(fā)生率較高(P＜0.05)；但在肝素濃度提高至20μg/ml和3μg/ml時，2.5mM和5mM的咖啡因作用效果無顯著差異(P＞0.05)。7.以TALP為基礎液，結合使用6mg/mlBSA和2.5mM咖啡因，30μg/ml肝素的作用與10μg/ml和20μg/ml的相比，頂體反應發(fā)生率較高(P＜0.05)；當咖啡因濃度提高至5mM時，10μh/ml肝素的作用與30μg/ml的相比，頂體反應發(fā)生率較高(P＜0.05)。8.m

5、KRB和高滲液都能使馬鹿精子體外獲能，但與同一培養(yǎng)條件下(38.5℃、5％CO2、飽和濕度)的其他試驗組相比，頂體反應發(fā)生率低(P＜0.05或P＜0.01)。9.十五組試驗方案中對馬鹿精子體外獲能培養(yǎng)效果較好(P＜0.05)的是：試驗二、試驗九、試驗十、試驗十一的方案。 獲能處理前后的馬鹿精子經固定、脫水、置換、包埋和聚合，用超薄切片機切片，再用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染片，最后于透射電鏡下觀察其超微結構的變化。觀察的結果表明：

6、 1.在電子顯微鏡下，馬鹿精子由頭部、頸部和尾部3部分組成。頭部呈棒狀，絕大部分被濃縮而電子密度較高的精核所占據(jù)；頂體似帽狀扣在精核之上，約占頭部的2/3左右，其前部較為膨大；頸部位于頭部和尾部之間，這個區(qū)域較短；尾部可分為中段、主段和終段。2.馬鹿尾部軸絲的結構類型為“9+2”；終段的微管結構類型為“9+9+2”。3.馬鹿精子獲能前，精子頭部質膜和頂體完整。精子獲能后，有的頂體質膜局部膨脹并呈泡狀，有的斷裂和丟失。頂體膨脹，外膜內