AF2364抑制精子獲能和受精能力.pdf

1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明；AF2364是一種很有潛力的男性避孕藥候選化合物。這一化合物通過(guò)干擾精子細(xì)胞與支持細(xì)胞間的黏附功能,可逆地誘導(dǎo)精母細(xì)胞以及精細(xì)胞從生精上皮丟失,但不影響精原細(xì)胞,從而導(dǎo)致給藥大鼠不育。一旦藥物代謝完成,精原細(xì)胞可重新開始精子發(fā)生,動(dòng)物即可恢復(fù)生育能力。AF2364能引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚集和解聚,導(dǎo)致支持細(xì)胞與精子細(xì)胞間黏附功能降低,最后使未成熟精母細(xì)胞和精子細(xì)胞從生精上皮丟失。然而AF2364對(duì)人類精子的作用尚未了

2、解,探索AF2364在人類精子中的作用及其分子機(jī)制,對(duì)開發(fā)新一代男性避孕藥具有重要意義。
　　 目的:
　　 研究AF2364對(duì)精子的抑制作用及其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.精子的處理
　　 精子與預(yù)溫HTF培養(yǎng)基等量混勻后,500g離心15min,棄去上清,精子用2ml的HTF進(jìn)行懸浮:精子懸液再用45％和90％Percoll間斷密度梯度離心(600g,15 min),所得下層活力較好精

3、子再用約10倍HTF懸浮,300g離心5 min。棄去上清液,再用HTF調(diào)整精子密度到2-3x107 cells/ml。
　　 1.金霉素染色法評(píng)價(jià)AF2364對(duì)精子獲能和頂體反應(yīng)的影響
　　 處理好的精子進(jìn)行分組,加入不同濃度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),以及孕酮,隨后精子于37℃進(jìn)行獲能培養(yǎng)4-5h,然后,分別加入等體積溶劑(作為對(duì)照)、并采用CTC染色法(金霉素染色法)評(píng)價(jià)精子獲能情

4、況。另外,在精子獲能培養(yǎng)5小時(shí)后,加入不同濃度的AF2364(0,10nM,100nM,1μM,10μM),繼續(xù)培養(yǎng)30min,然后,加入15μM P4(或2μg/ml rhuZP3β),誘發(fā)精子AR,15min,用CTC染色法評(píng)價(jià)頂體反應(yīng)率。
　　 2.卵子的處理
　　 選用8-10周齡的敘利亞金黃地鼠,陰道涂片觀察,判斷發(fā)情周期,之后注射超排卵激素,通過(guò)解剖取出輸卵管中的卵子。將卵子存放在HTF培養(yǎng)基中,加入透明質(zhì)酸

5、酶(2.5mg/ml)去除卵丘細(xì)胞,用培養(yǎng)基洗3次,再在胰酶(2.5mg/ml)的作用下,將卵子透明帶去除,并重復(fù)用培養(yǎng)基洗3次,放入2℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.精子穿卵實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AF2364對(duì)精子受精能力的影響
　　 處理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白對(duì)照,于37℃進(jìn)行獲能培養(yǎng)4-5h,將精子和卵子共培養(yǎng)3小時(shí)后,顯微鏡下觀察精子穿透卵子率(PR),以及精子穿卵指數(shù)(PI)。
　　 4.計(jì)算機(jī)輔

6、助精液分析系統(tǒng)(CASA)評(píng)價(jià)AF2364對(duì)精子活力和精子超激活運(yùn)動(dòng)的影響
　　 處理好的精子加入10μM的AF2364,孕酮和空白對(duì)照,于37℃進(jìn)行獲能培養(yǎng)4-5h,放入到10 mm×10 mm,深度20μm特定的載玻片上,通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)精子的捕捉,隨機(jī)選擇10個(gè)區(qū)段,在60赫茲下分析精子活力,以及超激活運(yùn)動(dòng)參數(shù)。
　　 5.AF2364對(duì)Forskolin激動(dòng)的精子獲能過(guò)程的影響
　　 精子獲能培養(yǎng)前,分成6組

7、:陽(yáng)性對(duì)照(孕酮),陰性對(duì)照(空白),Forskolin,Forskolin+孕酮,AF2364+Forskolin,AF2364+Forskolin+咖啡因,獲能培養(yǎng)5小時(shí)后,CTC染色,比較精子的獲能情況。
　　 6.AF2364在缺氯培養(yǎng)基中對(duì)精子獲能的影響
　　 精子培養(yǎng)在缺氯的培養(yǎng)基中,分成空白,孕酮和AF2364三組,獲能培養(yǎng)5小時(shí),CTC染色,觀察精子的獲能情況以及自發(fā)性頂體反應(yīng)情況。
　　 7.酶

8、免疫法測(cè)定AF2364作用下獲能精子的cAMP含量
　　 AF2364和對(duì)照組精子經(jīng)過(guò)獲能培養(yǎng)后,固定,提取cAMP,標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品加入到96孔中,通過(guò)與一抗,二抗結(jié)合,以及顯色劑的作用下,放入到酶標(biāo)儀中,讀取吸光度,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較AF2364組和對(duì)照組的cAMP含量差異。
　　 結(jié)果：
　　 通過(guò)CTC染色法,SPA以及CASA實(shí)驗(yàn),我們確定了AF2364抑制人類精子獲能和受精的作用。CTC染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

9、明,AF2364對(duì)人類精子獲能及其頂體反應(yīng)具有明顯的抑制效果,并且對(duì)精子獲能的抑制作用具有可逆性。SPA實(shí)驗(yàn)證明了AF2364在精子穿透卵子環(huán)節(jié),具有顯著的抑制作用,模擬了精子受精過(guò)程,評(píng)價(jià)了AF2364對(duì)精子受精能力的抑制效果。精子的CASA測(cè)試,發(fā)現(xiàn)AF2364不影響精子的活動(dòng)能力,但是對(duì)精子的超激活運(yùn)動(dòng)有明顯抑制效果,超激活運(yùn)動(dòng)的相關(guān)參數(shù)與對(duì)照組有著較大差異,精子超激活率也明顯下降。在設(shè)計(jì)了Forskolin以及缺氯培養(yǎng)的兩組實(shí)驗(yàn)