灰飛虱對毒死蜱和噻嗪酮的抗性機制研究.pdf

1、灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)是我國糧食作物上的一種重要害蟲，它不僅刺吸取食禾本科植物造成蟲害，還通過傳播病毒而引起水稻、玉米、小麥等重要糧食作物的病毒病。2000年以前灰飛虱在我國只是零星發(fā)生，長期作為次要害蟲對其進行防治。但自從2005年以來，該蟲在我國許多地區(qū)特別是江蘇、山東等省頻繁暴發(fā)。長期大面積和不合理使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致灰飛虱抗藥性的產(chǎn)生，灰飛虱對殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生是其近年來暴發(fā)頻繁的主要原因

2、之一。因此，必須加強灰飛虱的抗性治理，以期延緩其抗性進一步發(fā)展。明確殺蟲劑的抗性機制是害蟲抗性治理的前提。本文以灰飛虱室內(nèi)抗藥性篩選為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地研究了灰飛虱對毒死蜱和噻嗪酮的抗性生化、分子生物學(xué)機理。為更好地進行灰飛虱抗性治理和新藥開發(fā)提供新的依據(jù)。
　　 一、灰飛虱抗毒死蜱品系的抗性篩選及生化機理研究經(jīng)過對灰飛虱云南敏感品系(YN)連續(xù)32代的毒死蜱抗性篩選，與云南品系相比，毒死蜱抗性品系（YN-CPF）的抗藥性上升到213

3、.49倍;該抗性品系在連續(xù)12代無藥劑篩選壓力下其抗性衰退為83.08倍，以此作為抗性衰退品系（YN-DPF）。以YN，YN-DPF和YN-CPF品系為試蟲，通過解毒代謝酶活力和增效劑生物測定分析，研究了灰飛虱對毒死蜱的抗性生化機理。分別在YN-CPF、YN-DPF和YN品系中測定了PBO、DEM和TPP對毒死蜱的增效作用。結(jié)果顯示在抗性和抗性衰退品系中，多功能氧化酶抑制劑PBO分別對毒死蜱有3.77倍和2.28倍的增效作用，谷胱甘肽S

4、-轉(zhuǎn)移酶抑制劑DEM對毒死蜱的增效作用分別為2.82倍和1.79倍，羧酸酯酶抑制劑TPP對毒死蜱的增效作用分別為4.31倍和2.59倍，三種增效劑在敏感品系中均未對毒死蜱表現(xiàn)出顯著的增效作用。解毒代謝酶活力測定結(jié)果顯示抗性品系細(xì)胞色素P450單加氧酶活力為敏感品系的0.67倍;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力在兩品系間無顯著差異;酯酶活力在抗性和抗性衰退品系中分別為敏感品系中的4.15倍和1.92倍。此外，抗性品系乙酰膽堿酯酶最大反應(yīng)速率(Km)

5、是敏感品系的2.56倍，親和力及氧化毒死蜱抑制中濃度分別為敏感品系的1.81倍(Km-YN-CPF/Km-YN)和5.53倍(I50-YN-CPF/I50-YN)。以上結(jié)果說明，酯酶活性提高以及乙酰膽堿酯酶敏感性下降可能參與了毒死蜱的抗性形成，關(guān)于細(xì)胞色素P450-單加氧酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在毒死蜱抗性中的具體作用方式還需進一步研究。
　　 二、灰飛虱抗噻嗪酮品系的抗性篩選及生化機理研究對灰飛虱YN品系連續(xù)41代的噻嗪酮抗性篩

6、選，獲得了82.08倍的相對噻嗪酮抗性品系YN-BPF;對南京田間灰飛虱品系(NJ)連續(xù)12代的噻嗪酮抗藥性篩選，與初始NJ和YN品系相比，獲得的南京抗性品系(NJ-BPF)對噻嗪酮的相對抗性分別為4.46倍和96.58倍。以YN-BPF、NJ-BPF品系和YN品系為試蟲，通過解毒代謝酶活力和增效劑生物測定分析，初步研究了灰飛虱對噻嗪酮抗性的生化機理。分別在YN、NJ-BPF和YN-BPF品系中測定了PBO、DEM和TPP對噻嗪酮的增效

7、作用，結(jié)果顯示，三類增效劑在YN品系中對噻嗪酮都未表現(xiàn)出顯著的增效作用。在YN-BPF和NJ-BPF品系中，PBO分別對噻嗪酮有1.77倍和1.69倍的增效作用，細(xì)胞色素P450單加氧酶活力也分別比敏感品系中升高了1.39倍和1.89倍; DEM分別對噻嗪酮有1.02倍和1.03倍的增效作用，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活力在噻嗪酮抗、感品系間也未表現(xiàn)出顯著差異;酯酶抑制劑TPP分別對噻嗪酮有1.50倍和1.77倍的增效作用，酯酶活力與YN品系相

8、比分別升高了1.69倍和2.16倍。此外，YN-BPF和NJ-BPF品系中乙酰膽堿酯酶酶活力分別為YN品系的1.79和1.53倍。以上研究結(jié)果表明，酯酶及細(xì)胞色素P450單加氧酶活力的提高在一定程度上參與了噻嗪酮代謝抗性的形成，而乙酰膽堿酯酶活力升高對噻嗪酮抗性的形成可能也有一定的輔助作用。
　　 三、灰飛虱羧酸酯酶基因序列及表達量分析以云南敏感品系為材料，運用RT-PCR技術(shù)從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中成功驗證出31條灰飛虱羧酸酯酶

9、基因（暫名為Ls.CarE1-31）。分別在毒死蜱抗性和敏感品系中比較了這些基因的表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與YN品系相比，Ls.CarE1和Ls.CarE2在YN-CPF品系中分別具有32.6倍和7.52倍的顯著過量表達。以YN-DPF品系為實驗材料，分析過量表達的羧酸酯酶基因的抗性相關(guān)性，結(jié)果顯示，Ls.CarE1和Ls.CarE2在抗性衰退品系中的表達量分別為敏感品系中的8.6倍和1.09倍。這些結(jié)果表明，過量表達的Ls.CarE1與毒

10、死蜱抗性水平密切相關(guān)，而在毒死蜱抗性品系中過量表達的Ls.CarE2與抗性水平不存在一致的相關(guān)性。此外，毒死蜱抗性和敏感品系中的羧酸酯酶氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，毒死蜱抗性個體中Ls.CarE9、Ls.CarE16、Ls.CarE24和Ls.CarE25存在相對穩(wěn)定的點突變。由此推斷，不僅過量表達的Ls.CarE1參與了毒死蜱抗性的形成，部分羧酸酯酶點突變也可能是毒死蜱抗性形成的重要因子。
　　 四、灰飛虱細(xì)胞色素P450基因序列及表

11、達分析從灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出編碼細(xì)胞色素P450的序列112條（長度從100 bp到2000 bp以上），去掉較短的及重復(fù)測序的序列，RT-PCR共驗證出大于279 bp的灰飛虱P450基因55條，其中26條具有完整的氨基酸序列編碼區(qū)。進一步在灰飛虱抗、感噻嗪酮和毒死蜱的品系中分析了這些基因的表達情況。與敏感品系相比，CYP6CW1在噻嗪酮抗性品系中表現(xiàn)出9.75倍的過量表達。此外，3個P450基因（CYP4C， CYP4DE1和C

12、YP6AX）在毒死蜱抗性品系中表達量與敏感品系的相比分別下降了82.01％，89.22％和92.25％。這些結(jié)果表明，過量表達的CYP6CW1可能在噻嗪酮抗性中發(fā)揮重要作用，減少的毒死蜱活化也有可能參與了毒死蜱抗性的形成。
　　 五、毒死蜱抗性相關(guān)的羧酸酯酶基因RNAi功能分析及原核表達利用cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）克隆了灰飛虱Ls.CarE1的全長cDNA序列。Ls.CarE1全長共1839 bp，編碼547個氨基酸

13、，5'-UTR為87bp，3'-UTR為111bp.序列分析表明LsCarE1具有羧酸酯酶的基因序列特征，包括三個催化三聯(lián)體氨基酸殘基Ser215、Glu345、 His466;氧負(fù)離子孔Gly134、Gly135、 Ala217;半胱氨酸環(huán)殘基Cys92、 Cys110等編碼序列。氨基酸序列比對表明，Ls.CarE1與已報道的褐飛虱羧酸酯酶序列(GenBank: AAG40239.1)同源性達72％。因此推斷Ls.CarE1序列為灰飛

14、虱的羧酸酯酶基因序列。接著對其RNAi分析發(fā)現(xiàn)，以兩個不同濃度（80 ng/ul和200ng/ul）的Ls.CarE1-dsRNA連續(xù)6天喂養(yǎng)灰飛虱抗毒死蜱品系的一齡若蟲后，Ls.CarE1的表達量分別下降62.6％和68.72％。進一步以毒死蜱(800 mg/L).對RNA干擾后的抗性品系灰飛虱進行毒力測定，結(jié)果顯示:與對照相比，死亡率分別由33.7％上升至72.31％(80 ng/ul)和31.7％上升至69.56％(200 ng/