銀杏和葉籽銀杏microRNA的鑒定與分析.pdf

1、銀杏(Ginkgo biloba L.)系第四紀(jì)冰川之后惟一在中國(guó)保存下來(lái)的的孑遺種子植物。在其漫長(zhǎng)的演化歷程中，銀杏的種子和葉片發(fā)生了明顯的形態(tài)變異。世界上第一株葉籽銀杏(Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.)是由Shirai于1891年在日本發(fā)現(xiàn)的。葉籽銀杏系銀杏家族中的特異種質(zhì)，因具有明顯的葉生胚珠，而被視為觀賞佳品，同時(shí)具有重要的科研價(jià)值。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)葉籽銀杏的分類地位和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究，但對(duì)

2、于其發(fā)生機(jī)制還未有明確的定論。MicroRNAs(miRNAs)通過(guò)對(duì)靶mRNA直接切割或者抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用，其功能幾乎涉及到生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及環(huán)境響應(yīng)等生命進(jìn)程的各個(gè)方面。因此，對(duì)銀杏和葉籽銀杏開展miRNA的鑒定與功能研究具有重要的意義，為銀杏和葉籽銀杏的進(jìn)化以及葉籽銀杏產(chǎn)生葉生胚珠的分子機(jī)制研究提供了更廣闊的視角。
　　 本研究以銀杏和葉籽銀杏為試驗(yàn)材料，利用高通量測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)相

3、結(jié)合的方法，鑒定和分析了銀杏和葉籽銀杏中的miRNA。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建了銀杏和葉籽銀杏嫩葉小RNA文庫(kù)，共獲得高質(zhì)量序列46，191，036條，其中銀杏小RNA文庫(kù)包含24，227，844條，葉籽銀杏小RNA文庫(kù)包含21，963，192條。去接頭、去污染后分別在銀杏小RNA文庫(kù)和葉籽銀杏小RNA文庫(kù)中得到23，798，499(3，059，786unique)和21，717，220(

4、2，585，993unique)條cleanreads。
　　 (2)對(duì)小RNA文庫(kù)中的cleanreads進(jìn)行分析，并進(jìn)行分類注釋。兩個(gè)文庫(kù)中小RNA長(zhǎng)度多數(shù)都在19nt～24nt之間，長(zhǎng)度分布峰值在21nt和24nt兩處，其中21nt處均能達(dá)到60％以上，這與小RNA的典型長(zhǎng)度是一致的，其分布特征與其他裸子植物小RNA文庫(kù)也基本一致，而與一些被子植物的分布特征存在差異，這主要是與其加工生成的DCL酶種類不同。文庫(kù)中miRNA

5、與siRNA的含量豐富，在銀杏中分別達(dá)到12.5％和25.85％，在葉籽銀杏中分別達(dá)到13.73％和29.39％，表明在銀杏與葉籽銀杏中miRNA的調(diào)控有著重要的地位。
　　 (3)從銀杏小RNA文庫(kù)中鑒定出2，974，600條植物miRNA同源序列，其中包含20,262條uniquereads，它們隸屬于444個(gè)miRNA家族；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的復(fù)雜分析和嚴(yán)格篩選，共得到銀杏保守序列399，039條，這些序列隸屬24個(gè)miRNA家族

6、的69個(gè)保守miRNA成員。從葉籽銀杏小RNA文庫(kù)中鑒定出2，981，348條植物miRNA同源序列，其中包含18，685條uniquereads，隸屬于391個(gè)家族；經(jīng)篩選后得到葉籽銀杏保守序列460,037條，包含28個(gè)miRNA家族的82個(gè)保守miRNA成員。
　　 (4)在所建的銀杏及葉籽銀杏小RNA文庫(kù)中共預(yù)測(cè)到10條新miRNA候選者，其中在葉籽銀杏中預(yù)測(cè)到9條新miRNA候選者，分別為miRn1、miRn2、miR

7、n3、miRn4、miRn5、miRn6、miRn7、miRn8、miRn9、同時(shí)發(fā)現(xiàn)miRn1*；在銀杏中預(yù)測(cè)到2兩條新miRNA候選者，分別為miRn9、miRn10。這10條新miRNA候選者的前體能均形成特征性發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在20nt～23nt之間，最小折疊自由能(MFE，minimal folding free energy)都在-19.5kcal/mol以下，符合miRNA的典型特征。
　　 (5)應(yīng)用miRU算法

8、對(duì)銀杏及葉籽銀杏的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，在30個(gè)保守miRNA中，共預(yù)測(cè)到22個(gè)保守的miRNA家族中對(duì)應(yīng)的161個(gè)靶基因，大多數(shù)靶基因?yàn)橹参镛D(zhuǎn)錄因子，功能注釋顯示這些靶基因涉及到植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)的各個(gè)方面；在10個(gè)新miRNA中共發(fā)現(xiàn)37個(gè)靶基因，這些靶基因中有17個(gè)編碼功能蛋白，還有20個(gè)編碼未知功能的蛋白。
　　 (6)對(duì)銀杏和葉籽銀杏中miRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MIR156、MIR164、MIR168、M

9、IR169、MIR390、MIR397、MIR399、MIR408、MIR535、MIR1030在葉籽銀杏中的表達(dá)量要比在銀杏中的高，且差異極顯著；MIR159、MIR160、MIR394、MIR828在銀杏中的表達(dá)量要比葉籽銀杏中高，且差異極顯著。
　　 本研究通過(guò)對(duì)銀杏及葉籽銀杏miRNA的鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)在銀杏及葉籽銀杏中存在數(shù)量眾多的小RNA，這預(yù)示著銀杏及葉籽銀杏中可能存著復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。銀杏與葉籽銀杏m