我國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的亞型鑒定和分離株增殖特性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，其病毒粒子無(wú)囊膜，基因組是由一條單股、負(fù)鏈、環(huán)狀的DNA組成。PCV有PCV1和PCV2兩個(gè)基因型，PCV1對(duì)豬是非致病性的，PCV2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的主要病原，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2主要分為五個(gè)亞型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。本論文主要是對(duì)PCV2的亞型鑒定、PCV2的定量檢測(cè)方法、PCV

2、2a和PCV2b在PK15細(xì)胞上的增殖特性、PCV2a和PCV2b在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性進(jìn)行了研究。本文為PCV2的遺傳變異、臨床診斷和增殖特性的研究提供了一定的技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。本論文主要內(nèi)容如下:
　　試驗(yàn)1.我國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的亞型鑒定
　　PCV2在我國(guó)各省市均有流行，為了了解2011至2012年間江蘇、浙江和安徽三省部分豬場(chǎng)PCV2流行毒株的遺傳變異情況，本研究利用PCV2檢測(cè)引物從臨床送檢樣品

3、中篩選出28份陽(yáng)性病料，利用兩對(duì)PCV2全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)陽(yáng)性病料進(jìn)行PCV2全長(zhǎng)擴(kuò)增和測(cè)序，然后對(duì)它們進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，全長(zhǎng)序列為1767bp的有25個(gè)，為1768bp的有2個(gè)，為1766bp的有1個(gè);28個(gè)毒株之間的核苷酸同源性為94.2％-100％，與13個(gè)參考毒株的核苷酸同源性為93.9％-100％;有3株為PCV2a，1株為PCV2b，24株為PCV2d，沒(méi)有PCV2c和PCV2e。這表明當(dāng)前主要的流行毒株是PCV2d。

4、
　　試驗(yàn)2.兩種豬圓環(huán)病毒2型TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用
　　依據(jù)PCV2ORF1和ORF2基因的相對(duì)保守序列，分別設(shè)計(jì)合成兩組特異性引物和TaqMan探針，構(gòu)建分別包含PCV2ORF1和ORF2基因全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過(guò)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了兩種檢測(cè)PCV2的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。所建立的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系

5、，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上，擴(kuò)增效率均在90％-110％之間;重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)均小于5％;特異性強(qiáng);敏感性高，ORF1方法可達(dá)1.0×101copies/μL，ORF2方法可達(dá)1.0×102copies/μL。分別用兩種方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)并比較檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，由于一些臨床樣品中P1的存在，基于ORF1建立的定量檢測(cè)方法更為準(zhǔn)確、特異性更強(qiáng)，可用于PCV2的快速診斷和定量檢測(cè)。
　　試驗(yàn)3.豬圓環(huán)病毒2型兩亞型分離

6、株在PK15細(xì)胞上的增殖特性研究
　　為了研究豬圓環(huán)病毒2型的兩個(gè)主要亞型，即PCV2a和PCV2b在體外的增殖特性，我們分別將本實(shí)驗(yàn)室分離的PCV2a和PCV2b毒株接種PK15細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代，對(duì)兩亞型毒株的體外增殖特性進(jìn)行了研究。利用熒光定量PCR方法對(duì)各代次病毒含量進(jìn)行定量檢測(cè)，利用細(xì)胞免疫熒光方法對(duì)第10代、20代、30代、40代、50代、60代細(xì)胞毒進(jìn)行TCID50測(cè)定，比較兩亞型毒株在體外的增殖特性。研究結(jié)果表明，隨

7、著傳代次數(shù)的增加，兩亞型病毒的感染滴度均有明顯的提高，但是PCV2b的增殖速度要明顯高于PCV2a的。
　　試驗(yàn)4.豬圓環(huán)病毒2型兩亞型分離株在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性研究
　　為了研究PCV2a和PCV2b兩亞型毒株在Balb/c小鼠體內(nèi)的增殖特性，本文將兩亞型毒株分別接種Balb/c小鼠，利用熒光定量PCR、ELISA等方法對(duì)小鼠各臟器中的病毒含量、血清中病毒和抗體水平等指標(biāo)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，PCV2a和PCV