我國部分地區(qū)牛支原體病原的分離鑒定及ρ81基因序列分析和蛋白表達.pdf

1、牛支原體（Mycoplasma boris，M.bovis）主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎等。一旦牛場中存有M.bovis就很難消滅，它將會不斷地從老年動物傳染給新生?；蛐乱M的牛，而引起持續(xù)感染。目前已經(jīng)在歐洲和北美引起廣泛的流行并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。我國于2008年首次發(fā)生牛支原體感染的病例，已有部分省份陸續(xù)出現(xiàn)報道。
　　 本研究首先對湖北省患有牛呼吸道疾病的肺臟組織病料進行了病原的分離，對得到的分離物進行生化特性鑒定、

2、16S rRNA基因序列比較、特異性PCR鑒別實驗和血清學(xué)實驗，結(jié)果顯示，在40×顯微鏡下可以清楚看到分離物Hubei-1的菌落成明顯的“油煎蛋狀”，具有典型的支原體菌落特征；其生化特性與牛支原體完全吻合。16S rRNA基因序列比較結(jié)果顯不，Hubei-1的16S rRNA序列與牛支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G45株同源性為99.3％，與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M.agalactiae）PG2株的同源性為99％。用特

3、異性引物P3/P4進行PCR擴增，可以擴增出1.9 kb大小的片段，而無乳支原體則無擴增片段。將擴增出的片段克隆至pMD18-T-Vector，送上海生工進行測序。測序結(jié)果與參考Genbank中登錄的M.bovis PG45株進行比對，證明了分離物是牛支原體，此次為我國首次分離得到牛支原體。此后，又對其它7個省份送檢的牛肺臟用同樣的方法進行病原的分離鑒定，得到7株分離株，結(jié)果證明病原均為牛支原體。
　　 實驗利用PCR技術(shù)從8株

4、支原體分離株擴增p81基因，克隆到pMD18-T-Vector，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中送往上海生物工程技術(shù)公司進行DNA測序。結(jié)果表明p81基因全長2097 bp，我國分離得到的8株M.bovis分離株之間的同源性為99.4～99.9％，與PG45株同源性94.6％～94.9％，與無乳支原體PG2株的同源性為73.8％～74％。我國分離的M.bovis株高度保守，變異率低。M.bovis種內(nèi)高度保守，種間差異較大，p81基因可以作為

5、診斷M.bovis的靶基因，為M.bovis的鑒別診斷提供依據(jù)。
　　 測序結(jié)果還顯示p81基因在第165、684、1447、1674位密碼子TGA在支原體編碼色氨酸而在大腸桿菌是終止密碼子，TGG在大腸桿菌中編碼色氨酸。設(shè)計四對突變引物在此四個位置進行定點突變，將TGA突變?yōu)門GG，將突變后的p81基因截短成四部分，經(jīng)BamH I和SalⅠ雙酶切后克隆到同樣酶切處理的pET-30a和pET-32a中，經(jīng)PCR、酶切鑒定后的重組

6、質(zhì)粒進行誘導(dǎo)表達，得到4段重組蛋白。分別對重組蛋白進行Western blotting和間接ELISA試驗，結(jié)果證明，4段重組蛋白在NC膜上均無反應(yīng)條帶，而ELISA結(jié)果也顯示，只有用P81-3-1455蛋白作為抗原進行試驗時，P/N>2.1，證明反應(yīng)成立，可以用于進行血清學(xué)檢測。但是卻與PS2（牛傳染性胸膜肺炎國際標(biāo)準(zhǔn)血清）、M.agalactiae PG2陽性血清有交叉反應(yīng)。不能用于牛支原體和無乳支原體、牛肺疫的鑒別診斷。