華東地區(qū)奶牛無乳鏈球菌的分子流行病學調(diào)查及BP亞單位苗免疫效力分析.pdf

1、無乳鏈球菌屬于蘭氏分群中的B群鏈球菌，可引起多種動物和人類的感染，是奶牛隱性乳腺炎最常見的病原菌之一，給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。本研究通過采集華東地區(qū)奶牛隱性乳腺炎奶樣，分離、鑒定了其中的接觸性病原菌無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，分析了無乳鏈球菌的耐藥性、鑒定了無乳鏈球菌的耐藥基因、毒力基因等分子特征，并利用無乳鏈球菌菌株進行了多位點序列分型和脈沖場電泳分型技術(shù)分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，確定了菌株間的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，評價了牛源無乳鏈球菌

2、2b型菌毛骨架蛋白的免疫保護效力。研究成果對該地區(qū)奶牛乳腺炎的防治有參考價值。
　　1、華東地區(qū)奶牛隱性乳腺炎主要病原菌的分離鑒定
　　為了解華東地區(qū)奶牛隱性乳腺炎的接觸傳染性病原菌無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的流行情況，本研究從江蘇、安徽、山東、浙江、江西、福建六省和直轄市上海的33個奶牛場采集了619頭隱性乳腺炎患牛的奶樣，對其中的無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌進行了分離、鑒定。結(jié)果顯示:21個奶牛場的102頭牛的奶樣中分離到

3、無乳鏈球菌，有6個牛場的22頭牛的奶樣中分離到金黃色葡萄球菌，提示這兩種細菌是引起奶牛隱性乳腺炎的主要病原。
　　2、華東地區(qū)牛源無乳鏈球菌的耐藥性分析
　　目前控制奶牛乳腺炎主要依賴抗生素。本研究檢測了八種常見藥品對102株牛源無乳鏈球菌臨床分離株的敏感性。結(jié)果顯示:99％的菌株對四環(huán)素耐藥、63％的菌株對林可霉素耐藥，61％的菌株對紅霉素耐藥，52％的菌株對慶大霉素耐藥，并形成了19種耐藥譜型，3重耐藥譜最廣泛，占試驗菌

4、株的40.2％，且有7重耐藥菌株出現(xiàn)。但是有94％的菌株對青霉素G敏感，97％的菌株對頭孢噻肟敏感。該結(jié)果對該地區(qū)防治奶牛無乳鏈球菌乳腺炎具有指導(dǎo)意義。
　　3、華東地區(qū)牛源無乳鏈球菌毒力基因型的鑒定
　　選擇莢膜多糖合成酶基因、α相關(guān)蛋白基因、β蛋白編碼基因bac、β-溶血素結(jié)構(gòu)基因cylE、菌毛骨架蛋白基因spb、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gapC、C5a肽酶基因scpB等為檢測對象，用PCR方法對華東地區(qū)102株牛源無

5、乳鏈球菌臨床分離株的毒力基因進行了鑒定。結(jié)果顯示:試驗的菌株都含有cylE基因和spb2基因（編碼2b型菌毛骨架蛋白），但都缺乏bac和scpB基因;89％的菌株莢膜多糖Ⅰa型合成酶基因檢測陽性，11％的菌株莢膜多糖Ⅱ型合成酶基因檢測陽性;93％的菌株α相關(guān)蛋白基因檢測陰性，5％的菌株alp1基因檢測陽性，2％的菌株alp4基因檢測陽性。
　　4、華東地區(qū)牛源無乳鏈球菌分離株的分子分型
　　本研究分別用多位點序列分型(mul

6、tilocus sequence typing，MLST)和脈沖場電泳分型(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)構(gòu)建了102株無乳鏈球菌臨場分離株的系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示，102株試驗菌分屬6個序列型(sequencetype，ST)，即ST103，ST568，ST67，ST301，ST313和ST570。其中ST568和ST570為本研究發(fā)現(xiàn)的新ST型。eBURST軟件分析發(fā)現(xiàn)這6個序列型分屬于C

7、C103，CC67和CC64三個克隆群(clonal complexes，CCs)。PFGE分析將這些菌株劃分為27個型，其中型7，8，14，15，16，18，23和25為優(yōu)勢PFGE型，占所有菌株的70％(71/102)。結(jié)合莢膜類型、α相關(guān)蛋白類型、菌毛類型進行分析，結(jié)果確定主要流行菌株為ST103(58％)和ST568(31％)、莢膜分子Ia型且α相關(guān)蛋白未能定型。新的ST型及α相關(guān)蛋白未定型等新的分子特征的出現(xiàn)，顯示該地區(qū)牛源無

8、乳鏈球菌有區(qū)域特性。莢膜為Ia(89％)和Ⅱ型(11％)，所有菌株的菌毛都是2b型。保守的菌毛類型為牛無乳鏈球菌乳腺炎亞單位疫苗的研制提供了候選蛋白。
　　5、BP亞單位苗免疫效力的測定
　　本實驗克隆表達了牛源無乳鏈球菌菌株HAN201101的菌毛蛋白(BP)，Western blot分析顯示，重組BP能與HAN201101全菌制備的兔抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。進一步以小鼠為試驗?zāi)Ｐ?，用ELISA方法檢測BP亞單位苗免疫組小鼠