魚類海豚鏈球菌流行病學(xué)及診斷技術(shù)的研究.pdf

1、鏈球菌病是近幾十年新出現(xiàn)的一種世界性魚類細(xì)菌病。全球每年魚鏈球菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過1.5億美元。該病在各大洲的主要魚類養(yǎng)殖國(guó)家均有發(fā)生，在溫帶和熱帶、亞熱帶地區(qū)尤其嚴(yán)重。鏈球菌能危害幾乎所有的海、淡水養(yǎng)殖魚類，包括養(yǎng)殖中的重要品種如羅非魚、虹鱒、美國(guó)紅魚、鰤?mèng)~、牙鲆、大菱鲆、條紋鱸等多種魚類。自20世紀(jì)90年代以來，我國(guó)魚類鏈球菌感染的報(bào)道也日趨增多，在養(yǎng)殖的羅非魚、虹鱒、大菱鲆、牙鲆、紅鰭東方鲀、白鯧和美國(guó)紅魚中都有報(bào)道，并以羅非

2、魚最為嚴(yán)重，發(fā)病率一般達(dá)20-30％，發(fā)病魚死亡率達(dá)95％以上。
　　 本論文通過對(duì)廣東省養(yǎng)殖魚類細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查研究及病原菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌是網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類及淡水養(yǎng)殖羅非魚的首要病原菌。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海豚鏈球菌能夠感染多種養(yǎng)殖魚類，包括已經(jīng)報(bào)道過的美國(guó)紅魚、羅非魚和籃子魚，和一些尚未報(bào)道的本地魚種包括花尾胡椒鯛、紅鰭笛鯛、平鯛、卵圓鯧鰭、布氏石斑和金錢魚。而在這些海水養(yǎng)殖魚類中，海豚鏈球菌病在卵圓鯧鰭中最為常見，其次是

3、鯛科魚類和鮨科魚類。網(wǎng)箱養(yǎng)殖的海水魚類在水溫較高的6-9月份集中爆發(fā)，但淡水養(yǎng)殖羅非魚在水溫較低的11和12月份也會(huì)爆發(fā)。
　　 海豚鏈球菌疫苗已經(jīng)成為各個(gè)魚類養(yǎng)殖大國(guó)研究的熱點(diǎn)，盡管如此，有關(guān)海豚鏈球菌不同菌株的血清型的研究較少，海豚鏈球菌存在幾種血清型也不明確。本論文從分離的26株海豚鏈球菌菌株中選取6株并分別制備了其羅非魚抗血清，并用微量凝集的方法對(duì)海豚鏈球菌26株廣東分離株及1株浙江分離株和1株國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行交叉凝集反應(yīng)

4、。根據(jù)交叉凝集反應(yīng)結(jié)果，首次發(fā)現(xiàn)中國(guó)海豚鏈球菌不同分離株中存在2種血清學(xué)類型。另外，利用脈沖場(chǎng)電泳(Pulsed Field GelElectrophoresis，PFGE)的方法對(duì)所分離的海豚鏈球菌菌株進(jìn)行分子分型，結(jié)果顯示，包括標(biāo)準(zhǔn)株及浙江分離株在內(nèi)的28株海豚鏈球菌中，共獲得了18種不同的PFGE帶型。通過對(duì)這些菌株的PFGE圖譜的聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些分離株大致分為五個(gè)小群，三個(gè)大的分支。其中北美分離的標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29178單獨(dú)成

5、為一個(gè)分支，而中國(guó)分離株聚類成兩個(gè)大的分支。
　　 在分子診斷方面，我們對(duì)10株不同的海豚鏈球菌菌株的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、同源比對(duì)及分析，并設(shè)計(jì)出一對(duì)特異引物SP1和SP2。這對(duì)引物能特異地?cái)U(kuò)增出377 bp海豚鏈球菌ITS片段，而對(duì)其親緣關(guān)系較近的魚類病原鏈球菌和一些常見的淡海水魚類病原菌及一些其它細(xì)菌都不能擴(kuò)增出任何的片段。說明該引物具有較好的特異性，特別是克服了其他海豚鏈球菌特異引物對(duì)無乳鏈球菌不特異的缺點(diǎn)。靈敏度結(jié)

6、果表明，該特異引物在細(xì)菌個(gè)數(shù)為9個(gè)或DNA量為20 pg時(shí)仍能擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果，這個(gè)結(jié)果均要比其他特異引物的靈敏度要高。除了特異PCR的方法，本研究首次建立海豚鏈球菌LAMP檢測(cè)方法。首次從海豚鏈球菌不同菌株中中克隆得到海豚鏈球菌的助溶血因子基因(CAMP factor，cfi gene)的全閱碼框，并以此為靶序列，通過在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explore version3software設(shè)計(jì)了一系列引物，并篩選出了一組特異性較強(qiáng)的引

7、物。結(jié)果表明，我們建立的LAMP反應(yīng)體系具有較好的特異性和較高的靈敏度，DNA模板量為1pg時(shí)，仍可擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果，比特異PCR的方法靈敏度要高20-100倍。
　　 將以上兩種海豚鏈球菌的分子診斷技術(shù)用于對(duì)73個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法，只得到了6個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，且因?yàn)槎嗔思?xì)菌培養(yǎng)的過程，比較費(fèi)時(shí)；而利用所建立的海豚鏈球菌特異PCR技術(shù)卻獲得了18個(gè)陽(yáng)性結(jié)果;利用所建立的海豚鏈球菌特異LAMP技術(shù)獲得了26個(gè)陽(yáng)

8、性樣本。其中，用細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定方法得到的6個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，用特異PCR及LAMP的方法均顯示陽(yáng)性結(jié)果。用特異PCR方法檢測(cè)得到的18個(gè)陽(yáng)性樣本，用LAMP的方法均顯示陽(yáng)性結(jié)果。以上結(jié)果表明，所建立的兩種分子診斷技術(shù)跟傳統(tǒng)細(xì)菌分離的結(jié)果具有較好的吻合度；其次兩種分子診斷技術(shù)的靈敏度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)；最后，LAMP技術(shù)在魚類樣本中海豚鏈球菌的檢測(cè)上靈敏度比特異PCR技術(shù)要高。綜上所述，本研究所建立的特異PCR方法及LAMP將為海豚