轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對小鼠的安全性評價.pdf

1、本研究以昆明小鼠為動物模型(animalmodel)，應(yīng)用行為學(xué)、環(huán)境生態(tài)學(xué)、毒理學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和數(shù)理生態(tài)學(xué)等研究方法，從生理生化、毒理病理、生殖發(fā)育和遺傳多樣性等方面對轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷的安全性進(jìn)行了綜合評價。
　　 1.選取6周齡、體重18～22g的SPF級昆明小鼠200只，按編號隨機分成5組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)10只小鼠，雌雄各半。用不同含量(40％和60%)的轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷

2、及其親本非轉(zhuǎn)基因稻谷日糧分別喂養(yǎng)小鼠，親代小鼠飼養(yǎng)90天后開始繁殖子一代(F1)，子一代飼養(yǎng)90天后開始繁殖子二代(F2)，每代小鼠飼養(yǎng)180天。在180后分別從親代、子一代和子二代每組按編號隨機抓取10只小鼠對其血常規(guī)、血生化指標(biāo)和主要臟器指數(shù)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，P、F1和F2三代小鼠中，各處理組間器官指數(shù)和血生理生化指標(biāo)均不存在顯著差異(P>0.05)，轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對小鼠的生長、器官發(fā)育以及血生理生化未產(chǎn)生顯著影響。<

3、br>　　 2.將120只SPF級昆明小鼠分為5組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6只小鼠，雌雄各半，分別飼喂含不同劑量轉(zhuǎn)基因稻谷Bar68-1和常規(guī)非轉(zhuǎn)基因稻谷D68180天，持續(xù)3代。采用SDAP、FARRP和NCBI三大數(shù)據(jù)庫對磷絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)進(jìn)行致敏原序列對比，并用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬SWISS-MODEL預(yù)測PAT的三維構(gòu)象并對其進(jìn)行分析。每組按編號隨機抽樣6只小鼠，用ELISA分別檢測其腸道粘液免疫球蛋白A(sIgA)、血清

4、二胺氧化酶(DAO)和血清免疫球蛋白E(IgE)。蛋白質(zhì)生物信息學(xué)比對結(jié)果表明，PAT酶與數(shù)據(jù)庫中已知致敏原無同源性，三維構(gòu)象亦表明其與其他N-乙酰轉(zhuǎn)移酶大家族(NATSF)成員相似，無致敏性；轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組小鼠比較，sIgA、DAO和IgE三項檢測指標(biāo)值均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Bar基因的稻谷對小鼠無明顯致敏性。
　　 3.選擇體重在18～22gSPF級昆明小鼠100只，按編號隨機分成5組，分別飼喂含

5、不同劑量(40%和60%)的轉(zhuǎn)基因稻谷Bar68-1和常規(guī)非轉(zhuǎn)基因稻谷D68180天，持續(xù)2代。180天后每組按編號隨機抓取6只小鼠，分別檢測其腿肌、肝臟、腎臟、脾臟、小腸中是否含有Bar基因片段和其表達(dá)蛋白-磷絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，進(jìn)而探討轉(zhuǎn)基因成分在小鼠體內(nèi)的代謝殘留狀況；同時，還進(jìn)行了小鼠消化道內(nèi)對外源蛋白消化降解情況的初步檢測，并對小腸線粒體(mtDNA)基因組12SrDNA和16SrDNA保守區(qū)域測序。結(jié)果表明：采用定性

6、PCR法檢測的實驗組小鼠各臟器組織中沒有發(fā)現(xiàn)Bar基因片段和其表達(dá)的PAT蛋白酶；而小鼠消化道外源蛋白檢測結(jié)果表明PAT酶在胃腸道內(nèi)無耐受性，外源蛋白成分能夠被機體完全消化；小鼠小腸線粒體(mtDNA)基因組12SrDNA和16SrDNA保守區(qū)域的測序結(jié)果也無異常，沒有發(fā)現(xiàn)突變點。
　　 4.選取6周齡、體重18～22g的SPF級昆明小鼠120只，按編號隨機分成5組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6只小鼠，雌雄各半。用不同含量(40%和

7、60%)的轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷和非轉(zhuǎn)基因稻谷日糧分別喂養(yǎng)小鼠，親代小鼠飼養(yǎng)90天后開始繁殖子一代(F1)，每代小鼠飼養(yǎng)180天。在180后分別從親代和子一代每組按編號隨機抓取6只小鼠，提取腸道內(nèi)容物基因組DNA，利用細(xì)菌通用引物對細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)序列進(jìn)行PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物用變性梯度凝膠電泳(DGGE)后進(jìn)行比較、分析，并對小鼠腸道微生物主要優(yōu)勢菌群進(jìn)行了鑒別。結(jié)果顯示，飼喂轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷和非轉(zhuǎn)基因稻谷日糧的

8、小鼠腸道細(xì)菌種類和數(shù)量相似度大，無顯著差異(P>0.05)，轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對小鼠腸道微生物區(qū)系的種類、數(shù)量和分布沒有產(chǎn)生顯著影響。
　　 5.通過體外實驗評價轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1的細(xì)胞毒性，分別以25、50、100和200μg/mL轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白作用于昆明小鼠淋巴細(xì)胞，并各孵育2h、6h、24h，然后用CCK-8及中性紅攝取試驗檢測細(xì)胞毒性大小。在經(jīng)過不同的孵育時間段后，陽性對照組淋巴細(xì)胞的細(xì)胞存活

9、率與空白對照組相比，存在顯著差異(P<0.05)。其中，CCK-8試驗、中性紅試驗測得細(xì)胞存活率存在著明顯的損傷作用-時間效應(yīng)關(guān)系。轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白暴露組淋巴細(xì)胞存活率與非轉(zhuǎn)基因大米D68全蛋白暴露組淋巴細(xì)胞相比無明顯差異(P>0.05)，且與空白對照組細(xì)胞差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1與非轉(zhuǎn)基因大米D68兩者在細(xì)胞毒性上性狀相似，實質(zhì)等同，對淋巴細(xì)胞無明顯毒性作用。
　　 6.為探

10、測PAT酶長期脅迫下小鼠遺傳多態(tài)性的變化，應(yīng)用AFLP技術(shù)對飼喂轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷子二代(F2)小鼠遺傳多樣性進(jìn)行了研究分析。36只體重18～22g的F2代小鼠分為實驗組(Z2)和對照組(C2)，分別飼喂Bar基因稻谷Bar68-1和非轉(zhuǎn)基因稻谷D68。每組3個重復(fù)，每個重復(fù)6只小鼠，雌雄各半。6對引物組合擴增出108個AFLP條帶，其中多態(tài)性條帶占25.9%。在聚類圖上Z2組肝臟和小腸樣品和C2組肝臟和小腸樣品有微小差異，但差異