耐旱耐鹽抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花新材料的鑒定.pdf

1、棉花屬于重要的經(jīng)濟(jì)作物，但是受土壤干旱和鹽堿化面積日益加大的影響，棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，給生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，運(yùn)用基因工程方法創(chuàng)制耐旱耐鹽堿棉花新材料、新種質(zhì)，是目前棉花領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛，最有效的育種途徑。ERF(Ethylene responsive factor)類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類蛋白質(zhì)分子，普遍參與調(diào)控植物對外界各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。為了提高棉花對干旱和鹽堿的耐受能力，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將

2、分別從抗旱沙生植物胡楊(Populus euphratica Oliv.)和海水潮汐帶紅樹林植物秋茄(Kandelia candel(Linn.)Druce)中分離的PeDREB2a和KcERF轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建在含CP4抗性標(biāo)記基因的表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化棉花，對轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行鑒定與分析，獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因棉花株系，為棉花抗逆性的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)材料。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過轉(zhuǎn)化擬南芥，從已構(gòu)建好的5個(gè)表達(dá)載體中篩選出表達(dá)

3、性狀最佳、以rd29A為啟動子的雙價(jià)載體:pCAMBIA1302-KcERF-PeDREB2a，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入陸地常規(guī)棉R15，經(jīng)培養(yǎng)基培育、嫁接、定植、溫室培養(yǎng)、PCR分子檢測，最終獲得32株轉(zhuǎn)基因棉花。
　　(2)轉(zhuǎn)基因棉花通過冬季海南加代、夏季河北繼代，最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因棉花株系。
　　(3)對常規(guī)棉花R15進(jìn)行不同濃度的Kanamycin(Kan)噴施處理，初步確定基其Kan抗性篩選濃度為1500 mg/

4、L，待T3代轉(zhuǎn)基因棉花長至4～5片真葉時(shí)，進(jìn)行Kan噴施，初篩抗性棉株，剔除非抗性棉株。
　　(4)對T3代初篩抗性棉株進(jìn)行PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR分子檢測，獲得6株轉(zhuǎn)基因棉花，通過Southern雜交分析得出，外源基因多以單拷貝的方式插入受體細(xì)胞基因組中，轉(zhuǎn)基因植株的遺傳遵循孟德爾遺傳定律，而且，子代無基因沉默現(xiàn)象。
　　(5)對大田T3代轉(zhuǎn)基因棉花、以及對照組常規(guī)棉R15進(jìn)行草甘膦噴施處理，轉(zhuǎn)基因棉花表現(xiàn)出良好的除草劑抗性，

5、而對照組幾乎全部死亡，證明抗除草劑基因CP4-epsps轉(zhuǎn)入棉花體內(nèi)并進(jìn)行了表達(dá)。
　　(6)室內(nèi)種植部分轉(zhuǎn)基因棉花株系，對其進(jìn)行15％PEG6000和200mmol/LNaCl處理，觀察表型變化，同時(shí)通過干旱和鹽脅迫下相關(guān)生理指標(biāo)的分析得出，干旱和高鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因棉花的長勢明顯優(yōu)與對照組，轉(zhuǎn)KcERF-PeDREB基因棉花體內(nèi)的MDA含量顯著低于對照組，CAT、SOD活性和游離脯氨酸含量均高于對照組，同時(shí)，與對照組相比，轉(zhuǎn)基因