利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究肌抑素基因?qū)﹄u骨骼肌發(fā)育的影響.pdf

1、肌抑素（myostatin，又名GDF-8），為轉(zhuǎn)化生長因子-beta（TGF-β）超家族成員之一，其功能是負(fù)向調(diào)控骨骼肌的生長和發(fā)育。隨著研究的深入myostatin基因的一些新功能被逐漸發(fā)現(xiàn)，其在肌肉的發(fā)生、生長發(fā)育、再生、萎縮和退化等過程中均扮演著重要角色，日益顯現(xiàn)出該基因在功能上的重要性。為進(jìn)一步研究myostatin基因在胚胎發(fā)生和體內(nèi)骨骼肌發(fā)育中的功能作用和機(jī)制，本研究以雞為研究對象，分別在體外和體內(nèi)對myostatin進(jìn)行

2、了功能研究和結(jié)構(gòu)分析，獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體過程如下：
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法建立轉(zhuǎn)基因雞技術(shù)平臺：即將標(biāo)記基因（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，EGFP）克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，以phoenix或HEK293T細(xì)胞進(jìn)行泛嗜性VSV-G（水泡性口炎病毒囊膜蛋白）病毒包裝，并用包裝病毒體外侵染原代雞胚胎成肌細(xì)胞（Chicken Embryonic Myoblasts，CEM）檢測病毒侵染效率、整合及轉(zhuǎn)錄活性，然后大量包裝病毒并超離濃縮后，將

3、濃縮病毒進(jìn)行新生種蛋胚盤下腔接種，分別對接毒5天發(fā)育全胚和新生雛雞的不同臟器進(jìn)行基因組PCR鑒定分析。結(jié)果表明：包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有侵染和轉(zhuǎn)錄活性；體內(nèi)鑒定分析顯示標(biāo)記基因EGFP已整合到5天雞胚和一只雛雞的胸腺和皮膚組織基因組中，表明制備嵌合型GFP轉(zhuǎn)基因雞的技術(shù)平臺基本建立。
　　Myostatin基因在雞胚胎發(fā)育早期的功能初探：即針對雞myostatin基因編碼序列設(shè)計四條靶片段（19bp），并將其克隆到RNAi逆轉(zhuǎn)錄

4、病毒表達(dá)載體pSIREN-RetroQ中，體外分析表明RNAi能封閉靶基因myostatin的轉(zhuǎn)錄活性。利用轉(zhuǎn)基因雞技術(shù)平臺，大量包裝泛嗜性RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒，將濃縮病毒進(jìn)行新生種蛋胚盤下腔接種，回收5天接毒發(fā)育雞胚進(jìn)行全胚半定量分析。結(jié)果表明：重組RNAi病毒能夠下調(diào)5天胚胎myostatin的表達(dá)，并誘導(dǎo)MyoD和myogenin兩基因表達(dá)明顯上調(diào)，P21表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)myostatin下調(diào)組織部位的肌肉發(fā)生。另原位雜交分析表明：m

5、yostatin在胚胎不同組織部位表達(dá)量存在差異，在腦和眼等部位高表達(dá)，說明myostatin在雞胚胎早期發(fā)育中可能還具有其他重要作用。
　　Myostatin基因在雛雞胸肌發(fā)育中的功能初探：將包裝濃縮后的RNAi病毒和RNAi重組質(zhì)粒分別梯度接種0天雛雞的胸肌，并以PBS接種組雛雞為對照，飼養(yǎng)10天后宰殺雛雞觀察胸肌表型變化，提取各組雛雞胸肌組織RNA和蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明：胸肌接種myostatin的RNAi重組病毒或質(zhì)粒后

6、，能夠封閉靶基因myostatin的表達(dá)，誘導(dǎo)MyoD、myogenin、Pax7和mIGF-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和P21下調(diào)。RNAi接種組雛雞表現(xiàn)出胸肌豐滿肥厚，肌纖維肥大，肌纖維內(nèi)細(xì)胞核增多。
　　雞myostatin基因啟動子活性分析：為深入理解myostatin基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)克隆了肉雞和蛋雞5'端調(diào)控區(qū)2.0kb片段，序列分析表明不同種屬動物myostatin基因啟動子間保守性較高，而且在肉雞和蛋雞myostat

7、in基因啟動子區(qū)域也保守地存在著多個CAAT盒和E盒。此外，在其他種屬動物如牛、豬、羊等myostatin基因啟動子上的一些肌肉生長反應(yīng)元件在肉雞和蛋雞中也同樣保守存在。根據(jù)肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間的SNP位點(diǎn)的不同，設(shè)計了肉雞和蛋雞六個不同長度的啟動子片段并克隆到pGL3-Basic載體中，將重組載體分別轉(zhuǎn)染和相互轉(zhuǎn)染肉雞和蛋雞胚胎成肌細(xì)胞（CEM），通過Luciferase Assay System和β-Galact

8、osidase Enzyme Assay System兩檢測系統(tǒng)相結(jié)合，利用缺失分析的方法來比較肉雞和蛋雞啟動子活性及差異。結(jié)果表明：肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間轉(zhuǎn)錄活性存在差異，其中肉雞和蛋雞在0.2kb片段處活性差異較大。肉雞和蛋雞啟動子在各自細(xì)胞中活性均較高，但相比較而言蛋雞細(xì)胞環(huán)境更適于myostatin基因的轉(zhuǎn)錄。突變分析表明：0.2kb片段的-19bpSNP位點(diǎn)為該片段在肉雞和蛋雞間活性差異的關(guān)鍵位點(diǎn)。總之，肉雞

9、和蛋雞myostatin基因啟動子間確實(shí)存在轉(zhuǎn)錄活性差異，而這種轉(zhuǎn)錄活性差異與肉雞和蛋雞myostatin基因啟動子間的SNP位點(diǎn)的存在和肉雞和蛋雞不同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有關(guān)。
　　通過以上分析表明：轉(zhuǎn)基因雞技術(shù)平臺與RNAi技術(shù)相結(jié)合的方法來研究myostatin在雞胚胎發(fā)育早期的作用和出生后骨骼肌增生中功能取得了較好效果，結(jié)果表明myostatin不但在雞胚胎發(fā)育早期顯著影響著肌肉發(fā)生和相關(guān)基因的表達(dá)變化，而且可能具有除參與肌肉發(fā)生