非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈A、B單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的豬的重要傳染病之一，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障礙及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。目前，PRRS已遍及全球主要養(yǎng)豬國(guó)家和地區(qū)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程是依賴受體實(shí)現(xiàn)的，目前已鑒定的PRRSV的細(xì)胞受體

2、有4個(gè)：硫酸乙酞肝素HS、唾液酸粘附素Sn、CD163及波形蛋白Vimentin。HS主要是吸附PRRSV到易感細(xì)胞上，Sn介導(dǎo)PRRSV的內(nèi)吞，CD163協(xié)助Sn內(nèi)吞并介導(dǎo)PRRSV復(fù)制的脫衣殼、釋放過(guò)程，Vimentin與其它中間絲蛋白組成多聚體參與PRRSV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和遷移。
　　 非肌肉肌球蛋白Ⅱ型(NonmusclemyosinⅡ，NM-Ⅱ)廣泛存在于肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞中，在細(xì)胞遷移、細(xì)胞吸附、胞質(zhì)分裂及胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸

3、等發(fā)揮著重要的作用。非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈(NonmusclemyosinheavychainⅡ，NMHC-Ⅱ)可分3種亞型：NMHCⅡ-A、NMHCⅡ-B和NMHCⅡ-C，三者氨基酸同源性達(dá)60％-80％的，但其氨基端和羧基端氨基酸序列存在明顯差異，可據(jù)此制備特異性抗體識(shí)別不同亞型。本實(shí)驗(yàn)室利用PRRSVGP5蛋白的單克隆抗獨(dú)特型抗體(MAb2-5G2)在Marc-145細(xì)胞中檢測(cè)到NMHCⅡ-A并進(jìn)行探究，研究結(jié)果證明NMHCⅡ-A

4、羧基端蛋白可以降低PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染力，而NMHCⅡ-B羧基端蛋白能夠顯著增強(qiáng)PRRSV感染細(xì)胞。這些研究結(jié)果表明：NMHCⅡ-A、NMHCⅡ-B在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 本研究通過(guò)蛋白純化、免疫BALB/c小鼠、細(xì)胞融合與亞克隆技術(shù)，成功獲得了針對(duì)NMHCⅡ-A及NMHCⅡ-B羧基端蛋白的單克隆抗體，均屬于IgG亞類。這些單克隆抗體對(duì)相應(yīng)抗原表現(xiàn)出高度特異性，相互之間不存在

5、交叉反應(yīng)。I-ELISA和westernblot結(jié)果確定NMHCⅡ-A的單克隆抗體結(jié)合域在NMHCⅡ-A1812-1894AA處，NMHCⅡ-B的單克隆抗體抗原結(jié)合域在NMHCⅡ-B1759-1903AA處；疊加ELISA實(shí)驗(yàn)顯示各單克隆抗體的抗原結(jié)合表位相同或相近。通過(guò)制備小鼠腹水和抗體純化技術(shù)，獲得純化單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明單克隆抗體可以結(jié)合Marc-145細(xì)胞上的活性抗原，不同劑量的單克隆抗體與Marc-14