抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類的烈性傳染病。自1878年意大利首先發(fā)現(xiàn)至今，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆發(fā)和流行。尤其是高致病力禽流感可導(dǎo)致高達(dá)100％發(fā)病率和／或死亡率。并可直接感染人并致人死亡。而低致病力禽流感病毒同樣可以給養(yǎng)禽業(yè)帶來滅頂之災(zāi)，對(duì)人類的威脅同樣嚴(yán)重，目前，高致病性禽流感（HPAI）已被國際獸疫局規(guī)定為A類動(dòng)物傳染病。其防制已直接關(guān)系到養(yǎng)禽業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和人民的身體健康。 豬流感病毒（SI

2、V）最突出的流行病學(xué)特點(diǎn)是同時(shí)具有感染人、禽的潛力，而且豬可最大限度地被AIV和人流感病毒感染。因此，對(duì)SI的監(jiān)測(cè)作為預(yù)測(cè)和防止流感大暴發(fā)的最重要手段早已在歐美國家引起關(guān)注并達(dá)成共識(shí)。 A型流感病毒亞型眾多，易變。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了16種H亞型和10種N亞型，從而導(dǎo)致該病的診斷和治療非常困難。國內(nèi)對(duì)流感病毒的臨床診斷主要是對(duì)抗體的檢測(cè)。我國許多養(yǎng)雞場(chǎng)使用禽流感滅活苗，如何區(qū)分免疫雞群與感染雞群卻成為當(dāng)前面臨的一大難題因此，迫切需要

3、一種較為理想的禽流感診斷方法。流感病毒的HA和NA蛋白容易變異，但NP蛋白卻相對(duì)保守。因此，利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種所有亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法和診斷流感病毒亞型的方法。本研究利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3 HA的單抗，為對(duì)流感病毒的進(jìn)一步研究和建立針對(duì)流感病毒的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括： 分別用甲醛滅活的和Triton x-100裂解的禽流感H9N2病毒，禽流感病毒NP基因的原核表達(dá)產(chǎn)物

4、免疫Balb／c小鼠，取免疫脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)間接ELISA篩選，3次有限稀釋法克隆。共得到6株能穩(wěn)定分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4F4、1C3、1G11、1C2、1D10、2E7。經(jīng)3次亞克隆后，100％的雜交瘤細(xì)胞保持了分泌抗禽流感病毒NP蛋白抗體的能力。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明所有雜交瘤細(xì)胞確實(shí)為脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。間接免疫熒光說明單抗的結(jié)合活性很好。其中1G11、1D10單克隆

5、抗體小鼠腹水的效價(jià)最高，ELISA效價(jià)分別為2<'13>×100和2<'14>×100。單克隆抗體1G11、1D10分別為IgG1、IgG2a亞類。 研究結(jié)果表明，1G11、1D10單克隆抗體與禽流感病毒的NP蛋白能發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）、禽腺病毒1型（APMV-1）發(fā)生反應(yīng)。單克隆

6、抗體的獲得為禽流感病毒的研究及快速診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。 用H3N8病毒免疫Balb／c小鼠，取免疫脾細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)血凝抑制（HI）篩選，3次有限稀釋法克隆。共得到3株能穩(wěn)定分泌抗禽流感病毒HA蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B7、1C11、4G7。經(jīng)3次亞克隆后，100％的雜交 瘤細(xì)胞保持了分泌抗H3N8 HA蛋白抗體的能力。染色體計(jì)數(shù)結(jié)果表明所有雜交瘤細(xì)胞確實(shí)為脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞的雜交

7、產(chǎn)物。間接免疫熒光說明單抗的結(jié)合活性很好，單克隆抗體287、1C11、4G7／小鼠腹水的血凝抑制價(jià)為2<'12>、2<'8>、2<'7>；ELISA效價(jià)分別為2<'11>×100、2<'8>x100、2<'7>x100。單克隆抗體287、1C11、4G7分別為IgG2a、IgG1、IgG2a亞類。 研究結(jié)果表明，287、1C11、4G7單克隆抗體與H3N8流感病毒的HA蛋白能發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與其他亞型流感病毒反應(yīng)。單克隆抗體