葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及aflp遺傳多樣性分析

1、<p>　　園藝學(xué)報(bào)，（）：– 2014411223732382 http: // www. ahs. ac. cn </p><p>　　Acta Horticulturae Sinica</p><p>　　E-mail: yuanyixuebao@126.com </p&g

2、t;<p>　　收稿日期：2014–08–05；修回日期：2014–10–17 </p><p>　　基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD21B04）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題（魯農(nóng)良字[2011]7號(hào)）；國家植物種質(zhì)資源共享</p><p>　　平臺(tái)項(xiàng)目（2013-39） </p><p>　　葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及<

3、/p><p>　　AFLP遺傳多樣性分析 </p><p>　　吳岐奎，邢世巖*，王 萱，孫立民 </p><p>　?。ㄉ綎|農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安 271018） </p><p>　　摘 要：對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳關(guān)系分析。結(jié)果表明，葉用銀杏</p><p>　　種質(zhì)資源在黃酮和萜

4、內(nèi)酯類含量水平和DNA分子水平上都存在較高的遺傳多樣性。68份葉用銀杏種質(zhì)葉</p><p>　　片提取物成分中銀杏苦內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯B，銀杏總內(nèi)酯，黃酮的平均含量分別為0.0371%、</p><p>　　0.0185%、0.0280%、0.0133%、0.0243%、0.1216%、1.7103%。8對(duì)AFLP引物組合共擴(kuò)增出1 408條譜帶，</p><

5、;p>　　其中多態(tài)帶為99.28%，Nei’s基因多樣性和Shannon’s指數(shù)分別為0.1939和0.3142；種質(zhì)間的遺傳相似系</p><p>　　數(shù)在0.2924 ~ 0.7413之間，平均值為0.4888。種質(zhì)間基于黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析的聚類分析結(jié)果與基</p><p>　　于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析結(jié)果基本一致。利用黃酮和萜內(nèi)酯類含量和AFLP分析相結(jié)合的方&l

6、t;/p><p>　　法，篩選出高黃酮和萜內(nèi)酯類特異種質(zhì)，對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與保護(hù)有一定的積極意義。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：銀杏；種質(zhì)資源；葉用；黃酮；萜內(nèi)酯類；含量；AFLP；遺傳多樣性 </p><p>　　中圖分類號(hào)：S 792.95 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）12-2373-10 </p>&

7、lt;p>　　Genetic Diversity of Leaf-used </p><p>　　Ginkgo biloba</p><p>　　Germplasms Based on </p><p>　　Flavonoids and Ginkgolides Contents and AFLP Markers </p><p>　　W

8、U Qi-kui，XING Shi-yan*，WANG Xuan，and SUN Li-min </p><p><b>　?。?lt;/b></p><p>　　College of Forestry</p><p><b>　　，</b></p><p>　　Shandong Agricultura

9、l University</p><p><b>　　，</b></p><p><b>　　Tai’an</b></p><p><b>　　，</b></p><p><b>　　Shandong</b></p><p><

10、;b>　　271018，</b></p><p><b>　　China</b></p><p><b>　?。?lt;/b></p><p>　　Abstract：The genetic relationship of leaf-used </p><p><b>　　Gin

11、kgo</b></p><p><b>　　biloba</b></p><p>　　L. germplasms were evaluated by </p><p>　　flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers. The results showed that ric

12、h genetic diversity </p><p>　　existed in both flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers. The average content of leaf </p><p>　　extracts（Ga，Gb，Gc，Gj，Bb，Te，GF）in 68 leaf-used </p>

13、<p><b>　　G.</b></p><p><b>　　biloba</b></p><p>　　L. germplasms are 0.0371%，0.0185%，</p><p>　　0.0280%，0.0133%，0.0243%，0.1216% and 1.7103% respectively.

14、Among the 1 408 bands obtained from </p><p>　　8 selective primer pairs，99.28% of them were polymorphic. Nei’s genetic diversity was 0.1939，and </p><p>　　Shannon’s index was 0.3142. The molecular

15、 genetic similarity coefficients range from 0.2924 to 0.7413，</p><p>　　with an average of 0.4888. The results of hierarchical cluster analysis based the flavonoids and ginkgolides </p><p>　　cont

16、ents of different populations and UPGMA exhibited a good consistency. By the hybrid method of </p><p>　　flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers analysis，screen out the distinctive </p>&l

17、t;p><b>　　G.</b></p><p><b>　　biloba</b></p><p>　　germplasms of high-flavonoids and ginkgolides，would be valuable for germplasm management and </p><p>　　* 通

18、信作者 Author for correspondence（E-mail：xingsy@sdau.edu.cn） </p><p>　　2374 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 </p><p>　　utilization of leaf-use

19、d </p><p><b>　　G.</b></p><p><b>　　biloba</b></p><p>　　L. germplasm. </p><p>　　Key words：</p><p><b>　　Ginkgo</b></p&g

20、t;<p><b>　　biloba</b></p><p>　　；germplasm；leaf-used；flavonoids；ginkgolides；content；AFLP；</p><p>　　genetic diversity </p><p><b>　　銀杏（</b></p>&l

21、t;p>　　Ginkgo biloba</p><p>　　L.）是銀杏科單屬種植物，是第四紀(jì)冰川之后唯一保存下來的孑遺植物。</p><p>　　銀杏果、葉、材等用途廣泛，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益（邢世巖，2013）。自1965</p><p>　　年德國的Schwabe首次將銀杏葉提取物（</p><p>　　Gink

22、go biloba</p><p>　　extract，EGb）引入醫(yī)學(xué)實(shí)踐后，葉用銀杏</p><p>　　的栽培、生理活性物質(zhì)的提取和加工等一系列的研究逐步開展，目前法國、德國、新西蘭、美國等</p><p>　　對(duì)葉用銀杏藥物成分的研究處于領(lǐng)先水平（Dipak et al.，2014）。葉用銀杏以葉大、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)為主</p><p>　

23、　要選種目標(biāo)，優(yōu)先選擇葉內(nèi)有效成分含量高的種質(zhì)。中國是銀杏資源的起源、進(jìn)化及分布中心，擁</p><p>　　有大量的銀杏資源，積極開展葉用銀杏種質(zhì)資源研究具有重要意義（邢世巖，1997）。 </p><p>　　近年銀杏成為藥用研究開發(fā)的熱點(diǎn)植物之一，其生理活性物質(zhì)的含量水平是評(píng)價(jià)銀杏藥物制劑</p><p>　　最常用的指標(biāo)（Del Tredici，1991）。

24、目前從銀杏葉片中分離出來的成分較為復(fù)雜，主要有黃酮類、</p><p>　　萜內(nèi)酯類、聚戊烯醇等化合物，此外還有酚類、生物堿、有機(jī)酸、碳水化合物和礦質(zhì)元素等藥用成</p><p>　　分（史清文 等，1995）。有關(guān)銀杏葉提取物的研究大多集中在其主要成分的生理生化水平（陳佳 等，</p><p>　　2010；Chen et al.，2012）及藥用效果（Sandr

25、a et al.，2010；Zhou et al.，2011）方面。黃酮類和萜</p><p>　　內(nèi)酯類化合物（銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、銀杏苦內(nèi)酯J、白果內(nèi)酯B）是其中</p><p>　　最主要的兩大類生理活性物質(zhì)，具有改善血液循環(huán)抑制血栓形成、拮抗支氣管收縮、改善腦細(xì)胞代</p><p>　　謝水平及清除自由基等多種作用（Wang et al

26、.，2006a；Giedre et al.，2010）。 </p><p>　　分子標(biāo)記技術(shù)在銀杏種質(zhì)遺傳多樣性（Tsumura & Ohaba，1997；王利 等，2009；Singh et al.，</p><p>　　2010）、遺傳圖譜的構(gòu)建（劉叔倩 等，2001）、銀杏雌雄性別鑒定（Liao et al.，2009）、銀杏遺傳變</p><p>　

27、　異和特異種質(zhì)分析（Fan et al.，2004；Shen et al.，2005）等方面有較多的研究報(bào)道。AFLP標(biāo)記是</p><p>　　目前較為常用的分子標(biāo)記方法，綜合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，已用于觀賞銀杏（Wang et al.，</p><p>　　2006b）、雄株銀杏（郭彥彥，2006）、雌株銀杏（王利 等，2008）等研究，但針對(duì)于葉用銀杏種質(zhì)</p>

28、;<p>　　資源遺傳多樣性和特異種質(zhì)分析的研究報(bào)道較少。 </p><p>　　本研究中采用銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析與AFLP遺傳多樣性分析相結(jié)合的方法，篩選出</p><p>　　黃酮和萜內(nèi)酯類含量較高、遺傳特異性較強(qiáng)的葉用銀杏種質(zhì)，為葉用銀杏種質(zhì)資源的開發(fā)、利用及</p><p>　　特異種質(zhì)的鑒定、保護(hù)提供理論依據(jù)。 </p>

29、<p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p>　　1.1 試驗(yàn)材料 </p><p>　　68份葉用銀杏種質(zhì)資源材料（表1）來自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)銀杏種質(zhì)資源苗圃。于2013年4月，</p><p>　　每份材料采集幼嫩葉片3 ~ 4片，硅膠干燥保存?zhèn)溆?，用于DNA的提取。于2013年8月，每份材</p>

30、<p>　　料采集成熟葉片10片，用于葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量測(cè)定。 </p><p>　　1.2 葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量測(cè)定 </p><p>　　銀杏葉片提取物中的主要測(cè)定成分包括：銀杏苦內(nèi)酯A（Ga）、銀杏苦內(nèi)酯B（Gb）、銀杏苦內(nèi)</p><p>　　酯C（Gc）、銀杏苦內(nèi)酯J（Gj）、白果內(nèi)酯B（Bb）、銀杏萜內(nèi)酯（Te）和黃酮（GF）。 &l

31、t;/p><p>　　黃酮含量采用Rutin分光光度法（邢世巖 等，1998）測(cè)定。按GF（%，干樣）= Rutin（g · L-1）/</p><p>　　樣品質(zhì)量（g）× 稀釋倍數(shù) × 10-3 × 100計(jì)算。 </p><p>　　12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性

32、分析 2375 </p><p>　　萜內(nèi)酯類含量采用HPLC國際標(biāo)準(zhǔn)（van Beek et al.，1990）測(cè)定。色譜條件：儀器島津（Shimadzu）</p><p>　　LC-10AD HPLC，視差折光檢測(cè)器（RP-HPLC RI），色譜柱C18（Shimadzu），柱箱CTO-10A，柱溫</p><p>　　36 ℃，流動(dòng)相為

33、甲醇（CH3OH）︰水（H2O）= 1︰3，流速0.8 ~ 1.0 mL · min-1。銀杏葉萜內(nèi)酯類組</p><p>　　分含量及總量按下式計(jì)算：銀杏萜內(nèi)酯（%）= A酯/A標(biāo) × 100/R × 1.045/M。其中，R為內(nèi)酯的響應(yīng)</p><p>　　因子（RGa = 1.12，RGb =1.16，RGc =1.26，RGj =1.21，RBb =

34、1.11）；M為葉片樣品質(zhì)量（mg）；A酯為</p><p>　　萜內(nèi)酯類組分的峰面積，A標(biāo)為內(nèi)標(biāo)峰面積。 </p><p>　　根據(jù)銀杏葉各萜內(nèi)酯含量計(jì)算內(nèi)酯總量，銀杏葉內(nèi)酯總量（Te，%）= Ga（%）+ Gb（%）+ Gc</p><p>　?。?）+ Gj（%）+ Bb（%）= ΣGi（%）+ Bb（%）。 </p><p>　　表1

35、 葉用銀杏種質(zhì)來源、代號(hào)及性別 </p><p>　　Table 1 Plant geographical origin，coed and sexuality of leaf-used </p><p><b>　　G</b></p><p><b>　　.</b></p><p><b&

36、gt;　　biloba</b></p><p>　　germplasm </p><p><b>　　來源 </b></p><p><b>　　Origin </b></p><p><b>　　代號(hào) </b></p><p>　　Acce

37、ssion </p><p><b>　　性別 </b></p><p>　　Sexuality </p><p><b>　　來源 </b></p><p><b>　　Origin </b></p><p><b>　　代號(hào) </b&

38、gt;</p><p>　　Accession </p><p><b>　　性別 </b></p><p>　　Sexuality </p><p>　　安徽寧國Ningguo，Anhui Y1 雌Female 山東泰安Tai’an，Shandong Y35 雌Female </p><p>　

39、　Y2 雄Male Y36 雌Female </p><p>　　Y3 雌Female Y37 雌Female </p><p>　　福建蘆山Lushan，F(xiàn)ujian Y4 雄Male Y38 雌Female </p><p>　　福建尤溪Youxi，F(xiàn)ujian Y5 雌Female Y39 雌Female </p><p>　　

40、廣西桂林Guilin，Guangxi Y6 雄Male Y40 雌Female </p><p>　　貴州印江Yinjiang，Guizhou Y7 雄Male 山東郯城Tancheng，Shandong Y41 雄Male </p><p>　　Y8 雌Female Y42 雄Male </p><p>　　Y9 雌Female Y43 雄Male <

41、/p><p>　　湖北安陸Anlu，Hubei Y10 雄Male Y44 雄Male </p><p>　　湖南東安Dong’an，Hunan Y11 雄Male Y45 雄Male </p><p>　　Y12 雌Female Y46 雄Male </p><p>　　江蘇泰興Taixing，Jiangsu Y13 雌Female Y

42、47 雌Female </p><p>　　江西信豐Xinfeng，Jiangxi Y14 雌Female Y48 雌Female </p><p>　　山東海陽Haiyang，Shandong Y15 雄Male Y49 雌Female </p><p>　　Y16 雌Female Y50 雌Female </p><p>　　Y17

43、 雌Female 山東棗莊Zaozhuang，Shandong Y51 雌Female </p><p>　　Y18 雌Female 陜西延安Yanan，Shaanxi Y52 雌Female </p><p>　　山東濟(jì)寧Jining，Shandong Y19 雌Female 陜西楊陵Yangling，Shaanxi Y53 雌Female </p><p>　　

44、山東蒙陰Mengyin，Shandong Y20 雄Male 陜西長(zhǎng)安Chang’an，Shaanxi Y54 雄Male </p><p>　　Y21 雌Female 陜西周至Zhouzhi，Shaanxi Y55 雄Male </p><p>　　山東青島Qingdao，Shandong Y22 雌Female 四川萬源Wanyuan，Sichuan Y56 雌Female </

45、p><p>　　山東日照Rizhao，Shandong Y23 雄Male Y57 雌Female </p><p>　　Y24 雄Male 云南騰沖Tengchong，Yunnan Y58 雄Male </p><p>　　Y25 雌Female Y59 雌Female </p><p>　　Y26 雌Female Y60 雌Female

46、 </p><p>　　山東榮城Rongcheng，ShandongY27 雄Male 浙江富陽Fuyang，Zhejiang Y61 雌Female </p><p>　　Y28 雌Female 浙江麗水Lishui，Zheijiang Y62 雄Male </p><p>　　Y29 雌Female Y63 雄Male </p><p>

47、;　　山東泰安Tai’an，Shandong Y30 雄Male 浙江諸暨Zhuji，Zhejiang Y64 雌Female </p><p>　　Y31 雄Male Y65 雌Female </p><p>　　Y32 雄Male Y66 雌Female </p><p>　　Y33 雄Male Y67 雌Female </p><p&

48、gt;　　Y34 雌Female Y68 雌Female </p><p>　　1.3 AFLP分析 </p><p>　　用改良CTAB法（Doyle & Doule，1987）提取葉用銀杏種質(zhì)基因組總DNA，在CTAB提取緩</p><p>　　沖液中加入β–巰基乙醇和PVP以除去酚和多糖物質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA。AFLP</p

49、><p>　　分析參照Vos等（1995）的方法修改后進(jìn)行，用</p><p><b>　　Pst</b></p><p><b>　　Ⅰ+ </b></p><p><b>　　Mse</b></p><p>　?、駜?nèi)切酶組合對(duì)基因組DNA進(jìn)行限制<

50、/p><p>　　性酶切，并篩選出8對(duì)多態(tài)性高且穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增分析，擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 3730XL自動(dòng)</p><p>　　測(cè)序儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用GeneScan3.1軟件進(jìn)行分析，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣用于</p><p><b>　　統(tǒng)計(jì)分析。 </b></p><p>　　2376

51、 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 </p><p>　　表2 用于AFLP分析的接頭與引物 </p><p>　　Table 2 Adaptors and primers used for AFLP analysis </p><p&g

52、t;　　引物Primer 序列Sequence </p><p>　　接頭引物 Adaptor </p><p><b>　　Pst</b></p><p>　?、?5′-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3′；3′-CA TCT GAC GCA-5′ </p><p><b>　　Mse

53、</b></p><p>　　Ⅰ 5′- GA CGA TGA GTC CTG A G -3′；3′-TA CTC AGG ACT CAT-5′ </p><p>　　預(yù)擴(kuò)引物 Primer for the </p><p>　　pre-PCR amplification </p><p>　　P0 5′-GAC TGC GTA

54、 CAT GCA G-3′ </p><p>　　M0 5′-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3′ </p><p><b>　　選擇性擴(kuò)增引物 </b></p><p>　　Primer for AFLP amplification </p><p>　　P1 5′-GAC TGC GTA CAT GCA

55、 GAA-3′ </p><p>　　P2 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GAC-3′ </p><p>　　P3 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GAG-3′ </p><p>　　P4 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GAT-3′ </p><p>　　P5 5′-GAC TGC GTA CAT

56、 GCA GTA-3′ </p><p>　　P6 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GTC-3′ </p><p>　　P7 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GTG-3′ </p><p>　　P8 5′-GAC TGC GTA CAT GCA GTT-3′ </p><p>　　M1 5′-GAT GAG TCC

57、 TGA GTA ACA A-3′ </p><p>　　M2 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3′ </p><p>　　M3 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G-3′ </p><p>　　M4 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T-3′ </p><p>　　M5 5′

58、-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A-3′ </p><p>　　M6 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C-3′ </p><p>　　M7 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3′ </p><p>　　M8 5′-GAT GAG TCC TGA GTA ACT T-3′ </p><

59、p>　　1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 </p><p>　　利用Excel 2007對(duì)葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量進(jìn)行整理分析及相關(guān)計(jì)算，并采用SAS9.0軟件對(duì)</p><p>　　葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。利用Excel 2007對(duì)AFLP擴(kuò)增結(jié)果0/1數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，</p><p>　　依據(jù)每對(duì)引物擴(kuò)增出來的總條帶及多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)帶百分率。利用

60、POPGENE version 1.31</p><p>　　軟件計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)：等位基因數(shù)（</p><p><b>　　N</b></p><p>　　a）、有效等位基因數(shù)（</p><p><b>　　N</b></p><p>　　e）、Nei’s基因多樣性（&l

61、t;/p><p><b>　　H</b></p><p>　　）、Shannon’s</p><p><b>　　信息指數(shù)（</b></p><p><b>　　I</b></p><p>　　）。采用NTSYSpc version2.10e軟件計(jì)算各種質(zhì)間

62、的遺傳相似性矩陣，并進(jìn)行UPGMA</p><p>　　聚類分析以了解葉用銀杏種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系。 </p><p><b>　　2 結(jié)果與分析 </b></p><p>　　2.1 黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析 </p><p>　　根據(jù)色譜圖計(jì)算68份葉用銀杏的黃酮和萜內(nèi)酯類含量，圖1為Y52種質(zhì)的色譜圖。統(tǒng)計(jì)分析&

63、lt;/p><p>　　68份葉用銀杏種質(zhì)資源葉片銀杏的黃酮和萜內(nèi)酯類含量，記錄其最大值和最小值，并計(jì)算各種成分</p><p>　　的平均含量（表3），68份葉用銀杏種質(zhì)中Ga平均含量為0.0371%，其中Y16含量最多（0.1348%）；</p><p>　　Gb平均含量為0.0185%，其中Y64含量最多（0.0472%）；Gc平均含量為0.0280%，其中Y16

64、含量</p><p>　　最多（0.0690%）；Gj平均含量為0.0133%，其中Y64含量最多（0.0372%）；Bb平均含量為0.0243%，</p><p>　　其中Y52含量最多（0.0582%）；Te平均含量為0.1216%，其中Y64含量最多（0.2813%）；GF平均 </p><p>　　含量為1.7103%，其中Y64含量最多（2.4779%）。

65、雌雄銀杏之間的黃酮和萜內(nèi)酯類含量雖有所不同，</p><p>　　但其含量差別不大，差異并不顯著。 </p><p>　　圖1 Y52種質(zhì)的黃酮和萜內(nèi)酯類（A）和標(biāo)準(zhǔn)EGb（B）的HPLC色譜圖 </p><p>　　Fig. 1 HPLC chromatogram of flavonoids and ginkgolides（A）and EGb（B）in the

66、 Y52 germplasm </p><p>　　12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性分析 2377 </p><p>　　表3 葉用銀杏68份種質(zhì)資源的黃酮和萜內(nèi)酯類含量 </p><p>　　Table 3 The analysis of flavonoids and gink

67、golides contents for 68 leaf-used </p><p><b>　　G</b></p><p><b>　　.</b></p><p><b>　　biloba</b></p><p>　　germplasms %

68、</p><p><b>　　代號(hào) </b></p><p><b>　　Code </b></p><p><b>　　黃酮和萜內(nèi)酯類 </b></p><p>　　Flavonoids and ginkgolides </p><p><b

69、>　　最大值 </b></p><p><b>　　Maximum </b></p><p><b>　　最小值 </b></p><p><b>　　Minimum </b></p><p><b>　　平均值 </b></p

70、><p><b>　　Average </b></p><p><b>　　雌株平均值 </b></p><p>　　Average of female </p><p><b>　　雄株平均值 </b></p><p>　　Average of male&

71、lt;/p><p>　　Ga 銀杏苦內(nèi)酯A Ginkgolide A 0.1348（Y16）0.0083（Y3）0.0371 ± 0.02330.0389 ± 0.0280 0.0343 ± 0.0127</p><p>　　Gb 銀杏苦內(nèi)酯B Ginkgolide B 0.0472（Y64）0.0060（Y3）0.0185 ± 0.00880.018

72、1 ± 0.0093 0.0190 ± 0.0080 </p><p>　　Gc 銀杏苦內(nèi)酯C Ginkgolide C 0.0690（Y16）0.0119（Y3）0.0280 ± 0.01180.0284 ± 0.0116 0.0276 ± 0.0123</p><p>　　Gj 銀杏苦內(nèi)酯J Ginkgolide J 0.0372（Y6

73、4）0.0028（Y46）0.0133 ± 0.00780.0135 ± 0.0078 0.0131 ± 0.0078</p><p>　　Bb 白果內(nèi)酯B Bilobalide B 0.0582（Y52）0.0057（Y54）0.0243 ± 0.01210.0248 ± 0.0126 0.0236 ± 0.0114</p><p&

74、gt;　　Te 銀杏萜內(nèi)酯 Ginkgolides 0.2813（Y64）0.0028（Y6）0.1216 ± 0.05020.1247 ± 0.0569 0.1166 ± 0.0373</p><p>　　GF 黃酮Flavonoids 2.4779（Y64）1.2697（Y4）1.7103 ± 0.25131.7195 ± 0.2467 1.6954 

75、7; 0.2629</p><p>　　注：括號(hào)內(nèi)為材料代號(hào)。Note：Plant coed is in bracket. </p><p>　　根據(jù)葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量對(duì)68份種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（圖2），在歐式距離為0.9 </p><p>　　圖2 葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量系統(tǒng)聚類圖 </p><p>　　Fig.

76、2 Dendrogram of leaf-used of </p><p><b>　　G. biloba</b></p><p>　　L. germplasms based on flavonoids and ginkgolides contents </p><p>　　2378

77、 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 </p><p>　　處，將其劃分為6大類。第Ⅰ類包含48份種質(zhì)，第Ⅱ類包含12份種質(zhì)，第Ⅲ類包含兩份種質(zhì)，第</p><p>　?、纛惏?份種質(zhì)，第Ⅴ類包含2份種質(zhì)，第Ⅵ類包含1份種質(zhì)。 </p><p>　　2.2 遺傳多樣性分析 <

78、/p><p>　　從64對(duì)引物中篩選出8對(duì)多態(tài)性高且表現(xiàn)穩(wěn)定的引物組合對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增</p><p>　?。ú糠纸Y(jié)果見圖3），，每對(duì)引物的鑒別效率為100%。8對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 408條譜帶，擴(kuò)增片</p><p>　　段大小范圍在70 ~ 500 bp之間，其中多態(tài)性條帶為1 398條，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增多態(tài)性條帶174</p>

79、<p>　　條，每對(duì)引物組合多態(tài)性條帶百分率（</p><p><b>　　PPB</b></p><p>　?。?9.28%。8對(duì)引物組合共產(chǎn)生181條特異性條帶（包</p><p>　　括3條缺失帶），不同引物組合產(chǎn)生的特異性條帶數(shù)量有所不同，</p><p><b>　　P</b>

80、</p><p><b>　　-GAC/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CTC產(chǎn)生的特異性條帶</p><p>　　最多，為30條，包括兩條特異性條帶，</p><p><b>　　P</b></p>

81、<p><b>　　-GAG/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CTG產(chǎn)生的特異性條帶最少（11條）。不同種質(zhì)</p><p>　　產(chǎn)生的特異性條帶也有所不同，其中Y64產(chǎn)生的特異性條帶最多（11條），Y33、Y44、Y46未產(chǎn)生</p><p>&

82、lt;b>　　特異性條帶。 </b></p><p>　　圖3 引物組合P-GAC/M-CTG對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源的AFLP擴(kuò)增圖譜 </p><p>　　Fig. 3 AFLP patterns of 68 leaf-used </p><p><b>　　G. biloba</b></p><p

83、>　　L. germplasms by P-GAC/M-CTG </p><p>　　運(yùn)用POPGENE version 1.31軟件對(duì)各位點(diǎn)觀測(cè)的</p><p><b>　　N</b></p><p><b>　　a、</b></p><p><b>　　N</b>&

84、lt;/p><p><b>　　e、</b></p><p><b>　　H</b></p><p><b>　　、</b></p><p><b>　　I</b></p><p>　　進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，68份葉用銀杏</p>

85、<p>　　種質(zhì)觀測(cè)等位基因數(shù)（</p><p><b>　　N</b></p><p>　　a）平均值為1.9928，有效等位基因數(shù)（</p><p><b>　　N</b></p><p>　　e）平均值為1.1608，Nei’s基因多</p><p><

86、;b>　　樣性（</b></p><p><b>　　H</b></p><p>　?。┢骄禐?.1939，Shannon’s信息指數(shù)（</p><p><b>　　I</b></p><p>　?。┢骄禐?.3142（表4）。由此可見8對(duì)引物</p><p

87、>　　組合在所分析的68份葉用銀杏種質(zhì)材料中多態(tài)性好，表明其遺傳多樣性處于一個(gè)較高的水平。 </p><p>　　表4 基于不同引物組合的葉用銀杏種質(zhì)遺傳多樣性水平 </p><p>　　Table 4 Genetic diversity level of leaf-used </p><p><b>　　G. biloba</b>&

88、lt;/p><p>　　L. germplasm based on different primer combination </p><p><b>　　引物組合 </b></p><p><b>　　Primer </b></p><p><b>　　多態(tài)性條帶 </b><

89、;/p><p>　　Polymorphic </p><p><b>　　bands </b></p><p><b>　　多態(tài)帶比例/% </b></p><p>　　Parentage of </p><p>　　polymorphic band </p>&

90、lt;p><b>　　Na Ne H</b></p><p><b>　　I</b></p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAA/</b></p><p><b>　　M</b></p&g

91、t;<p>　　-CAG 160 98.77 1.9877 ± 0.1108 1.3243 ± 0.3598 0.1954 ± 0.1852 0.3088 ± 0.2498 </p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAA/</b></p><

92、p><b>　　M</b></p><p>　　-CTG 183 98.92 1.9892 ± 0.1037 1.2912 ± 0.3099 0.1873 ± 0.1626 0.3062 ± 0.2195 </p><p><b>　　P</b></p><p><b&g

93、t;　　-GAC/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CAC 180 100.00 2.0000 ± 0.0000 1.2775 ± 0.3080 0.1791 ± 0.1614 0.2844 ± 0.2189 </p><p><b>　　P&l

94、t;/b></p><p><b>　　-GAC/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CTA 172 98.85 1.9885 ± 0.1069 1.3122 ± 0.3458 0.1923 ± 0.1759 0.3095 ± 0.2341

95、</p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAC/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CTC 165 99.40 1.9940 ± 0.0776 1.3135 ± 0.3284 0.1967

96、± 0.1714 0.6158 ± 0.2321 </p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAC/</b></p><p><b>　　M</b></p><p>　　-CTG 188 100.00 2.0000 ±

97、 0.0000 1.3166 ± 0.2908 0.2071 ± 0.1542 0.3372 ± 0.2067 </p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAG/</b></p><p><b>　　M</b></p><

98、p>　　-CTG 171 99.42 1.9942 ± 0.0762 1.2903 ± 0.2650 0.1962 ± 0.1431 0.3251 ± 0.1940 </p><p><b>　　P</b></p><p><b>　　-GAT/</b></p><p><

99、;b>　　M</b></p><p>　　-CAG 179 98.90 1.9890 ± 0.1048 1.3105 ± 0.3061 0.1971 ± 0.1687 0.3168 ± 0.2300 </p><p>　　平均Mean 174 99.28 1.9928 ± 0.0725 1.1608 ± 0.31

100、55 0.1939 ± 0.1653 0.3142 ± 0.2231 </p><p>　　12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性分析 2379 </p><p>　　2.3 遺傳關(guān)系分析 </p><p>　　不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.2924 ~ 0.7413

101、之間，平均0.4888，表明各葉用銀杏種質(zhì)間遺傳</p><p>　　變異大，遺傳關(guān)系復(fù)雜。其中Y19與Y37之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.7413），說明二者的親緣關(guān)</p><p>　　系最近，遺傳差異性最??；Y55和Y63之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.2924），說明二者的親緣關(guān)系最</p><p>　　遠(yuǎn)，遺傳差異性最大。Y39與其他葉用銀杏種質(zhì)間的平均相似系數(shù)

102、最大（0.5450）；Y36與其他葉用</p><p>　　銀杏種質(zhì)間的平均相似系數(shù)最小（0.4133），說明Y36與其他葉用銀杏資源相似性低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 </p><p>　　基于AFLP遺傳相似系數(shù)對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖4），在相似系</p><p>　　數(shù)0.50處可將其劃分為4大類：A大類包含24份種質(zhì)，B大類包含25份種質(zhì)，

103、C大類包含8份種</p><p>　　質(zhì)，D大類包含11份種質(zhì)。地理距離較近的種質(zhì)并沒有聚在一起，這說明種質(zhì)的聚類與地理距離并</p><p><b>　　沒有明確的關(guān)系。 </b></p><p>　　圖4 葉用銀杏種質(zhì)資源基于AFLP的UPGMA聚類圖 </p><p>　　Fig. 4 UPGMA dendro

104、gram of leaf-used of</p><p><b>　　G. biloba</b></p><p>　　L. germplasm based on AFLP markers </p><p>　　2380 園 藝 學(xué) 報(bào)

105、 41卷 </p><p>　　2.4 黃酮和萜內(nèi)酯類含量與UPGMA聚類的比較分析 </p><p>　　通過對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源分別進(jìn)行黃酮和萜內(nèi)酯類含量聚類分析及UPGMA聚類分析，</p><p>　　含量聚類結(jié)果中Ⅰ大類與UPGMA聚類中A、B大類對(duì)應(yīng)，Ⅱ大類與D大類對(duì)應(yīng)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ</p>

106、<p>　　大類與D大類對(duì)應(yīng)，結(jié)果表明兩種聚類結(jié)果具有較高的一致性。 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　3.1 葉用銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析 </p><p>　　本研究中依據(jù)邢世巖等（2002）的葉子藥物成分檢測(cè)方法，采用高效液相色譜（HPLC），對(duì)國</p><p&g

107、t;　　際通用的歐洲van Beek等（1990）測(cè)定方法進(jìn)行了修改。 </p><p>　　68份葉用銀杏種質(zhì)資源在葉片6種成分含量上都表現(xiàn)出差異性，通過系統(tǒng)聚類分析，將其劃分</p><p>　　為6大類。其中有10份種質(zhì)（Y16、Y17、Y33、Y40、Y45、Y46、Y52、Y53、Y62和Y64）的黃</p><p>　　酮和萜內(nèi)酯類含量較高，達(dá)到良種選育

108、標(biāo)準(zhǔn)（邢世巖，2013）。其中Y64的GB、GJ、Te、GF含量</p><p>　　最高，Y16的GA、GC含量最高，Y52的BB含量最高。這10份種質(zhì)可以作為葉用銀杏生產(chǎn)的主</p><p>　　要種植資源。其他類型的種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量普遍較低，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中如何通過人工</p><p>　　選擇、雜交育種或基因工程等方式培育出高黃酮和萜內(nèi)酯類的葉用銀

109、杏新品種，有待于進(jìn)一步研究。 </p><p>　　本研究中銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量在雌雄株中并沒有明顯的差異表現(xiàn)。因此，在葉用銀杏品種</p><p>　　選擇過程中雌雄性別可不作為重點(diǎn)指標(biāo)考慮。 </p><p>　　3.2 葉用銀杏遺傳多樣性和遺傳關(guān)系 </p><p>　　銀杏以中國為中心，廣泛種植于世界各地，不同種植區(qū)的氣候變化和地

110、區(qū)間較多的引種雜交使</p><p>　　銀杏表現(xiàn)出較豐富的多樣性。Singh等（2010）采用AFLP技術(shù)對(duì)印度西南地區(qū)的20株銀杏進(jìn)行分</p><p>　　析，其多態(tài)帶比例為80.47%，聚類關(guān)系較為復(fù)雜，地理來源與遺傳距離之間沒有確定的關(guān)系，本研</p><p>　　究中UPGMA聚類結(jié)果與之一致，可能與銀杏在不同區(qū)間內(nèi)的廣泛引種有關(guān)。王利等（2008）研究

111、</p><p>　　了49個(gè)銀杏雌株種質(zhì)的遺傳關(guān)系，其AFLP多態(tài)帶比例為98.44%，各品種間的相似系數(shù)為0.39 ~ </p><p>　　0.83，表明它們存在不同程度的遺傳差異。本研究中8對(duì)多態(tài)性較好的AFLP引物組合對(duì)68份葉用</p><p>　　銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，條帶清晰，且多態(tài)性較高（99.28%）。通過對(duì)各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)（</p>

112、;<p><b>　　N</b></p><p><b>　　a、</b></p><p><b>　　N</b></p><p><b>　　e、</b></p><p><b>　　H</b></p>

113、<p><b>　　、</b></p><p><b>　　I</b></p><p>　?。┍砻?，葉用銀杏種質(zhì)具有較強(qiáng)的遺傳多樣性，這可能與銀杏為雌雄異株的特性有關(guān)。 </p><p>　　UPGMA聚類分析結(jié)果與銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量聚類分析結(jié)果具有較高的一致性。含量聚類</p><p&g

114、t;　　分析將68份種質(zhì)分為6大類，UPGMA聚類將68份種質(zhì)分為4大類，各大類黃酮和萜內(nèi)酯類含量</p><p>　　呈遞增趨勢(shì)。因此，AFLP分子標(biāo)記可以在一定程度上反映葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類的含</p><p>　　量情況，在葉用銀杏種質(zhì)資源的開發(fā)、利用的過程中，應(yīng)該結(jié)合黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析和AFLP</p><p>　　分析數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)。

115、 </p><p>　　3.3 葉用銀杏特異種質(zhì)的篩選 </p><p>　　王利等（2008）研究了觀賞銀杏、雌株銀杏的特異種質(zhì)。郭彥彥（2006）研究了雄株銀杏的特</p><p>　　異種質(zhì)。本研究中通過對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)的黃酮和萜內(nèi)酯類含量進(jìn)行分析，其中10份種質(zhì)表現(xiàn)</p><p>　　出一定的特殊性，黃酮和萜內(nèi)酯類含量水平較高

116、。10份特異種質(zhì)中來源相同的Y16與Y17、Y33</p><p>　　與Y40、Y45與Y46、Y52與Y53之間的親緣關(guān)系較近，在UPGMA聚類分析中較為聚集，其中</p><p>　　Y17、Y40、Y46、Y52多態(tài)性較好、特異性較高。 </p><p>　　12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性分析

117、 2381 </p><p>　　本研究首次針對(duì)中國主要68份葉用銀杏種質(zhì)資源，采用植物生理學(xué)及遺傳學(xué)兩方面相結(jié)合的</p><p>　　試驗(yàn)方法進(jìn)行研究和分析驗(yàn)證，在葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP分子層面上對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資</p><p>　　源的分析得到統(tǒng)一。結(jié)合黃酮和萜內(nèi)酯類含量、多態(tài)性、相似性、特異位點(diǎn)、聚類結(jié)果對(duì)所試材料</p&

118、gt;<p>　　進(jìn)行分析，山東海陽的Y17（內(nèi)酯T-5號(hào)）、山東泰安的Y40（內(nèi)酯T-6號(hào)）、山東郯城的Y46（黃</p><p>　　酮F-1號(hào)）、陜西延安的Y52、浙江麗水的Y62、浙江諸暨的Y64（黃酮F-2號(hào)）在系統(tǒng)聚類分析和</p><p>　　UPGMA聚類分析中分別屬于不同的大類，具有較強(qiáng)的代表性，是極其重要的特異種質(zhì)，應(yīng)加以保</p><

119、p><b>　　護(hù)和利用。 </b></p><p>　　References </p><p>　　Chen Jia，Xie Zuo-quan，Ye Sai，Wang Ke，Wang Shi-dong，Zhang Qing-hua. 2010. Effect of </p><p>　　Ginkgo biloba</p>

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121、物GBE50對(duì)HepG2細(xì)胞甘油三酯代謝的影響. 中國藥理學(xué)通</p><p>　　報(bào)，26 (7)：961–964 </p><p>　　Chen Jia-shiong，Chen Yung-hsiang，Huang Po-hsun，Tsai Hsiao-ya，Chen Yuh-lien，Lin Shing-jong，Chen Jaw-wen. 2012. </p><

122、p>　　Ginkgo biloba</p><p>　　extract reduces </p><p>　　high-glucoseinduced endothelial adhesion by inhibiting the redox-dependent interleukin-6 pathways. Cardiovascular Diabetology，11：49–60. &l

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124、n of rainfall over NCR Delhi using regional background error </p><p>　　statistics in WRF-3DVAR model. Meteorology and Atmospheric Physics，125 (1–2)：17–42. </p><p>　　Doyle J J，Doule J L. 1987. A

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