大豆鮮籽粒蔗糖含量的研究及糖代謝相關(guān)基因的克隆與功能分析.pdf

1、菜用大豆是指大豆鼓粒末期(R6～R7)籽粒飽滿，莢色翠綠時(shí)采青食用的大豆專(zhuān)用型品種，是一種重要的豆類(lèi)蔬菜。外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)是菜用大豆兩個(gè)基礎(chǔ)的品質(zhì)要素，與菜用大豆這兩個(gè)性狀緊密相關(guān)的百莢鮮重、百粒鮮重及鮮籽粒蔗糖含量是菜用大豆品質(zhì)遺傳研究的重要性狀。依據(jù)菜用大豆這些特殊的目標(biāo)性狀，本研究在對(duì)我國(guó)323份栽培大豆種質(zhì)資源進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)、鑒定的基礎(chǔ)上，通過(guò)關(guān)聯(lián)作圖和連鎖作圖方法發(fā)掘與大豆百莢鮮重、百粒鮮重及鮮籽粒蔗糖含量相關(guān)的QTL或關(guān)聯(lián)位

2、點(diǎn)。同時(shí)，通過(guò)同源克隆的方法獲得大豆蔗糖代謝關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化酶及蔗糖磷酸合成酶的基因，對(duì)這些基因進(jìn)行大豆發(fā)育中籽粒及大豆根、莖、葉、花中的表達(dá)特性進(jìn)行分析，并檢測(cè)了這些組織中相關(guān)酶的活性及糖代謝物的含量。進(jìn)一步將大豆轉(zhuǎn)化酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，并將大豆轉(zhuǎn)化酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因功能缺失突變體，觀測(cè)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系相應(yīng)酶的活性，蔗糖、葡萄糖的含量，以及生長(zhǎng)發(fā)育中幼苗根長(zhǎng)、蓮座葉直徑等性狀。以了解這些酶對(duì)組織中糖分累

3、積及植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.按照菜用大豆品質(zhì)要求直接通過(guò)表型篩選得到一批優(yōu)異鮮籽粒性狀的種質(zhì)，并通過(guò)關(guān)聯(lián)分析方法鑒定得到與百莢鮮重、百粒鮮重、鮮籽粒蔗糖含量相關(guān)的58個(gè)（次）標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，涉及36個(gè)SSR標(biāo)記。在這58個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，有9個(gè)蔗糖-SSR關(guān)聯(lián)點(diǎn)，28個(gè)百莢鮮重-SSR關(guān)聯(lián)點(diǎn)，21個(gè)百粒鮮重-SSR關(guān)聯(lián)點(diǎn)，這49個(gè)莢粒鮮重相關(guān)位點(diǎn)共涉及29個(gè)SSR標(biāo)記。進(jìn)一步對(duì)這些顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行特異等位

4、變異及載體材料發(fā)掘，鑒定出一批優(yōu)異等位變異位點(diǎn)及其典型載體材料。同時(shí)用連鎖作圖的方法共定位到11個(gè)(次)QTL與百莢鮮重（5個(gè)）、百粒鮮重（4個(gè)）、鮮籽粒蔗糖含量（2個(gè)）相關(guān)。兩種不同作圖方法檢測(cè)QTL的結(jié)果中均涉及到的SSR標(biāo)記有4個(gè)，分別為Satt136、Satt208、Satt251及Satt445。
　　2.以擬南芥細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因及蔗糖磷酸合成酶基因序列為探針，分別同源克隆得到兩個(gè)大豆細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因GmCInv1和Gm

5、CInv2，兩個(gè)大豆蔗糖磷酸合成酶基因GmSPS1和GmSPS2。GmCInv1和GmCInv2的開(kāi)放閱讀框分別為2040bp和1665bp，分別編碼680個(gè)和555個(gè)氨基酸殘基。推測(cè)兩蛋白分子量分別為76.96kD和63.30kD，等電點(diǎn)分別為5.94和6.22。GmSPS1和GmSPS2的開(kāi)放閱讀均為3177bp，編碼1059個(gè)氨基酸殘基。推測(cè)兩蛋白分子量分別為117.97和117.99kD，等電點(diǎn)分別為5.99和6.09。同源性分

6、析發(fā)現(xiàn)GmCInv1和GmCInv2與其他植物細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列相似性較高，并與酸性轉(zhuǎn)化酶基因完全分開(kāi)。GmSPS1與GmSPS2在同源性分析中與擬南芥ATSPS1F及ATSPS2F分到一組，但親緣關(guān)系最近的卻是葡萄和茄。
　　3.隨著大豆籽粒的發(fā)育進(jìn)程，籽粒中蔗糖含量呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，葡萄糖含量前期降低較快，后期降低較慢。淀粉含量在不同品種中隨發(fā)育時(shí)期變化的趨勢(shì)不同。在大豆根、莖、葉、花中，蔗糖含量大都低于葡萄糖含量，這

7、與籽粒中情況恰好相反。隨著大豆籽粒發(fā)育進(jìn)程，籽粒中細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶、液泡轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性均是逐步下降，且液泡轉(zhuǎn)化酶活性一直高于細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶活性高于細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性;蔗糖磷酸合成酶活性在不同品種中變化規(guī)律不同。非籽粒組織中，一般葉片和花中轉(zhuǎn)化酶活性較高;蔗糖磷酸合成酶活性有的品種是花中最高，有的是根中最高。隨著籽粒的發(fā)育進(jìn)程，兩個(gè)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因GmCInv1與GmCInv2的表達(dá)模式不同:GmCInv1呈上升趨勢(shì)，而GmCInv2有

8、下降趨勢(shì)，對(duì)籽粒中轉(zhuǎn)化酶活性具有明顯效應(yīng)的可能是GmCInv2。兩細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因均是在根中表達(dá)量高于其他組織。大豆蔗糖磷酸合成酶基因隨籽粒發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量逐步升高，在根中的表達(dá)量高于其他非籽粒組織。糖代謝物含量與酶活性、酶活性與酶基因表達(dá)量之間均存在一定的影響關(guān)系，但沒(méi)有完全的控制效果。
　　4.將GmCInv1及GmCInv2分別轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(WT)及擬南芥細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶基因功能缺失突變體cinv1，將獲得純合陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系分

9、別稱作W組轉(zhuǎn)基因株系和M組轉(zhuǎn)基因株系。除GmCInv2的M11株系外，GmCInv1、GmCInv2的其他轉(zhuǎn)基因株系均有目的基因的表達(dá)及擬南芥自身轉(zhuǎn)化酶AtCinv1基因的表達(dá)，WT沒(méi)有大豆基因表達(dá)，突變體cinv1沒(méi)有大豆基因的表達(dá)且自身AtCinv1基因的表達(dá)極低。GmCInv1及GmCInv2的表達(dá)，專(zhuān)一性的提高了轉(zhuǎn)基因株系的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶活性，對(duì)液泡轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性沒(méi)有明顯效應(yīng)。轉(zhuǎn)基因株系的蔗糖含量及其蔗糖含量/葡萄糖含量

10、比被降低，表明轉(zhuǎn)化酶活性的提高促進(jìn)了蔗糖的分解。與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，基因效應(yīng)包括:促進(jìn)幼苗根伸長(zhǎng)，促進(jìn)蓮座葉生長(zhǎng)，促進(jìn)蓮座葉數(shù)目增加，增加抽薹數(shù)，增加株高，延長(zhǎng)開(kāi)花期。兩轉(zhuǎn)化酶基因在某些功能上具有差異。大豆GmCInv1及GmCInv2的表達(dá)對(duì)擬南芥突變體cinv1的一些表型具有補(bǔ)償作用，可以恢復(fù)其表型，但不一定能完全恢復(fù)至WT水平。
　　5.轉(zhuǎn)GmSPS1、GmSPS2的轉(zhuǎn)基因株系均有目的基因的表達(dá)，但兩基

11、因的6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中僅有1個(gè)株系Line5的SPS活性與WT有顯著性差異。Line5的蔗糖含量明顯提高，與WT相比，Line5植株高度及幼苗根長(zhǎng)得到顯著增加。其他5個(gè)株系雖然SPS酶活性沒(méi)有顯著提高，但大部分株系仍在所考察的6個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育表型中有某一個(gè)或兩個(gè)與WT產(chǎn)生顯著性差異。這些結(jié)果表明擬南芥中SPS活性的提高能夠促進(jìn)蔗糖的累積，并引起植株生長(zhǎng)表型的改變;大豆SPS基因在擬南芥中表達(dá)后可能受到其他因素的抑制，以至不能提高擬南芥SPS的